中國(guó)HIV-1流行株對(duì)廣譜中和抗體VRC01敏感性的分子機(jī)制研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)膜區(qū)的糖蛋白具有高度的變異性，可以導(dǎo)致病毒逃逸人體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)，是人類研究有效的艾滋病疫苗的主要障礙。在過(guò)去四年中，通過(guò)綜合應(yīng)用先進(jìn)的技術(shù)策略，研究者們分離發(fā)現(xiàn)了多個(gè)完全人源的具有高效中和能力的單克隆廣譜中和抗體。根據(jù)廣譜中和抗體設(shè)計(jì)相應(yīng)的疫苗成為HIV-1疫苗研究的熱點(diǎn)方向。VRC01，是研究者采用高通量特異性擴(kuò)增單個(gè)B細(xì)胞抗體的技術(shù)于2010

2、年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜中和活性的單克隆抗體。研究表明，VRC01作用于HIV-1膜蛋白表面的CD4結(jié)合位點(diǎn)，主要作用于gp120蛋白的loop D區(qū)域、CD4結(jié)合區(qū)和V5區(qū)域。VRC01能夠高效中和90％以上的國(guó)內(nèi)外HIV-1流行株。但在研究中仍發(fā)現(xiàn)了少數(shù)的分離毒株對(duì)VRC01具有不同程度的耐受，深入研究這些流行毒株對(duì)廣譜中和抗體VRC01的耐受機(jī)制，并闡明耐受株在體內(nèi)免疫選擇壓力作用下對(duì)VRC01的中和敏感性的變化規(guī)律，能夠幫助人們更好地了

3、解病毒與廣譜中和抗體的相互作用機(jī)制，同時(shí)能夠?yàn)榭贵w相關(guān)疫苗的研制和應(yīng)用提供重要的信息。
　　 為了研究中國(guó)HIV-1流行株與廣譜中和抗體VRC01的相互作用特點(diǎn)并揭示流行株中耐受毒株的耐受機(jī)制，本研究首先通過(guò)序列比對(duì)分析和假病毒的中和實(shí)驗(yàn)篩選到分離自同一份HIV-1 CRF08_ B'C亞型感染者樣本的兩株病毒CNE47和CNE48，這兩株病毒的膜蛋白序列高度相似，94％以上的氨基酸序列完全相同，在與VRC01相互作用的主要區(qū)域

4、中，loopD區(qū)域僅有一個(gè)氨基酸的差異，CD4結(jié)合區(qū)則完全相同，V5區(qū)域有4個(gè)氨基酸不同。但是這兩株病毒對(duì)VRC01的中和敏感性相差24倍左右，其中CNE47對(duì)VRC01相對(duì)不敏感(IC50=9.27μg/ml)，對(duì)VRC01表現(xiàn)出一定程度的耐受，而CNE48則對(duì)VRC01高度敏感(IC50=0.39μg/ml)。對(duì)CNE47和CNE48的loop D和/或V5區(qū)域進(jìn)行了整體互換和單個(gè)氨基酸的突變，結(jié)果表明，包含有V5區(qū)域互換的突變株對(duì)

5、VRC01的中和敏感性都發(fā)生了明顯的變化。因此，V5區(qū)域的不同是導(dǎo)致CNE47和CNE48對(duì)VRC01中和敏感性不同的主要原因。另外，將CNE47的460位的天門冬酰胺突變?yōu)楸彼?N460A)時(shí)，可以顯著增強(qiáng)病毒對(duì)VRC01的中和敏感性。我們選取了來(lái)自不同感染者的毒株CNE23和CNE30進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些毒株中，V5區(qū)域同樣是決定病毒對(duì)VRC01中和敏感性的主要區(qū)域，其中460位的天門冬酰胺(N460)也能夠促進(jìn)病

6、毒對(duì)VRC01的耐受。結(jié)構(gòu)模擬分析結(jié)果表明，HIV-1 gp120的460位的天門冬酰胺可以增加VRC01重鏈的61位精氨酸與gp120之間的空間位阻，進(jìn)而促進(jìn)病毒對(duì)VRC01的耐受。假病毒的膜蛋白與VRC01的結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明，病毒對(duì)VRC01的結(jié)合能力決定了其對(duì)VRC01的中和敏感性。隨后，我們研究了含有突變的病毒對(duì)其它的CD4結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)蛋白和抗體的敏感性變化，結(jié)果表明:loop D和V5區(qū)域的變化都沒(méi)有明顯影響病毒對(duì)b12的敏感性;

7、在突變株中僅有包含有潛在糖基化位點(diǎn)的突變降低了相應(yīng)假病毒對(duì)Ibalizumab的中和敏感性，但V5區(qū)域的變化促進(jìn)了病毒對(duì)可溶性CD4(soluble CD4，sCD4)蛋白的不同程度的中和耐受。
　　 為了進(jìn)一步研究在免疫選擇壓力下，體內(nèi)病毒種群的變化情況和病毒對(duì)VRC01中和敏感性的變化情況，我們對(duì)分離出CNE47和CNE48的50號(hào)感染者的后續(xù)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的系列樣本進(jìn)行了研究。首先從后續(xù)樣本中擴(kuò)增出了大量的HIV-1膜蛋白基因

8、，通過(guò)序列分析、假病毒構(gòu)建和中和實(shí)驗(yàn)等方法研究了代表性毒株對(duì)VRC01及其它CD4結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)抗體的中和敏感性的變化。結(jié)果表明，分離自同一份樣本的HIV-1膜蛋白序列的親緣關(guān)系最近。在gp120與VRC01相互作用的主要區(qū)域中，與CNE47相比，后續(xù)系列樣本中分離出的病毒膜蛋白的loop D區(qū)和CD4結(jié)合區(qū)完全相同，V5區(qū)域存在1個(gè)或5個(gè)氨基酸的差異。代表克隆對(duì)VRC01、b12和Ibalizumab的中和敏感性均與CNE47相似。這說(shuō)

9、明，在50號(hào)感染者體內(nèi)，后續(xù)時(shí)間點(diǎn)分離出的所有毒株均對(duì)VRC01耐受。通過(guò)本研究可以得出以下結(jié)論:
　　 1、在HIV-1中，gp120蛋白的V5區(qū)域是決定病毒對(duì)VRC01中和敏感性的主要區(qū)域。
　　 2、V5區(qū)域中460位的天門冬酰胺能夠促進(jìn)病毒對(duì)VRC01的耐受。
　　 3、HIV-1膜蛋白與VRC01的結(jié)合能力決定了病毒對(duì)VRC01的中和敏感性。
　　 4、在同一感染者體內(nèi)可以同時(shí)存在對(duì)VRC01中