攜帶中國HIV-1流行株RT基因的新型SHIV構(gòu)建及生物特性研究.pdf

1、目前,HIV疫苗尚未研發(fā)成功,抗病毒藥物治療在艾滋病治療中占主導地位?？笻IV藥物以逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑為主,其特異性靶點為HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因?？蒲腥藛T已研發(fā)多種新一代逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,其在細胞水平表現(xiàn)出較高抗病毒活性,其藥效學評價和耐藥機制研究迫切需要包含HIV藥物靶點的SHIV恒河猴動物模型。RT-SHIV是在猴免疫缺陷病毒(SIV)主體框架中替換上人免疫缺陷病毒(HIV)rt基因構(gòu)建出的新型嵌合病毒,其主要特點是包含藥物靶點特異

2、性的HIVrt基因。該模型的建立能為篩選逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑提供一個理想的體內(nèi)評價環(huán)境,可以極大的推動艾滋病藥物的藥效學評價研究。在此基礎上,觀察HIV病毒rt基因在逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑作用下的變異情況,為以后耐藥性RT-SHIV/動物模型研究提供信息。
　　 本課題主要分為兩部分,一、使用B亞型RT-SHIV/TC感染中國恒河猴,了解動物感染情況,確定檢測指標,建立RT-SHIV/TC中國恒河猴動物模型；二、構(gòu)建攜帶有中國HIV-1流行株

3、rt基因的新型SHIV病毒,進行感染性篩選和動物感染實驗。
　　 第一部分:建立RT-SHIV/TC中國恒河猴動物模型。具體通過病毒擴增、病毒滴定和藥物篩選實驗,探索性研究現(xiàn)有RT-SHIV/TC在不同細胞上感染情況,在此基礎上,進行RT-SHIV/TC病毒猴體感染實驗及體內(nèi)傳代研究,建立RT-SHIV/TC中國恒河猴感染模型,之后分別通過緊急預防和疾病慢性感染期給藥兩種方式對感染猴進行藥物治療,確定RT-SHIV/TC對逆轉(zhuǎn)錄

4、酶抑制劑的敏感性。這些數(shù)據(jù)表明:PBMC來源病毒比CEMx174細胞來源病毒具有更強毒力；RT-SHIV/TC能有效感染中國恒河猴,且經(jīng)猴體傳代后具有更強的毒力；細胞和動物水平驗證了RT-SHIV/TC對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的敏感性。該部分研究初步建立了RT-SHIV/TC恒河猴藥物篩選動物模型。同時,還進行了RT-SHIV/TC粘膜感染中國恒河猴探索。
　　 第二部分:攜帶有中國HIV-1流行株rt基因的新型SHIV的構(gòu)建。本研究以

5、SIVmac239為主要骨架,分別從HIV-1病毒液和HIV-1質(zhì)粒中擴增出目的rt基因(從3’開始的1-1652核苷酸)替換插入SIVmac239的相應區(qū)域而構(gòu)建出RT-SHIV。主要構(gòu)建出五種不同類別的攜帶有中國HIV-1流行株rt基因的RT-SHIV病毒,將這些重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,收集病毒上清,分別感染TZM-bl細胞系,對克隆的生物學活性進行細胞水平鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-SHIV/AE具有細胞感染活性,且對CEMx174

6、細胞系和恒河猴PBMC具有很好的感染性,通過Ghost細胞確定該病毒為CCR5嗜性病毒。動物實驗說明,RT-SHIV/AE能有效感染中國恒河猴。該新型嵌合病毒的構(gòu)建將為我國艾滋病藥物評價提供針對性病毒。
　　 本研究初步建立了RT-SHIV/TC恒河猴藥物篩選動物模型,能用于現(xiàn)有抗病毒藥物的篩選和比較醫(yī)學研究。成功構(gòu)建了細胞及動物水平具有感染活性的攜帶中國流行亞型HIV-1 rt基因片段的新型RT-SHIV病毒株,使用該病毒建立