利用RNA干擾技術下調Lon基因表達的生物學效應研究.pdf

1、背景與目的: Lon是高度保守的ATP依賴蛋白酶，近期研究發(fā)現作為線粒體蛋白，它對細胞生長和增殖發(fā)揮重要調節(jié)作用。本文將腫瘤細胞內的Lon基因表達下調，觀察腫瘤細胞的增殖及凋亡，以探討Lon蛋白在真核細胞中的功能。 方法: 應用RT-PCR方法觀察乳腺癌細胞MCF7、肺癌細胞NCI-H23等8種腫瘤細胞系和一種正常成纖維細胞系COS7細胞中Lon基因的表達情況。我們選用表達較為豐富的MCF7細胞株作為研究的靶細胞，設計針對Lon

2、蛋白酶的小干擾RNA(siRNA)，構建pSilencer U6 2.1-Lon真核表達載體，用脂質體法轉染人乳腺癌MCF7細胞，觀察細胞形態(tài)學變化。并經G418篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞后，收集轉染后細胞總RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot法檢測Lon表達水平的變化；細胞計數法觀察細胞的生長增殖能力；采用高溫、紫外線照射、順鉑處理來誘導轉染細胞發(fā)生應激反應，用噻唑藍法(MTT法)檢測細胞增殖活性的變化；流式細胞術檢測

3、siRNA誘導后的細胞周期和凋亡率。Caspase-3活性檢測Lon下調介導的凋亡途徑。 結果: Lon基因在8種腫瘤細胞系以及正常細胞系中均有表達。RT-PCR和Western blot顯示重組質粒pSilencer U6 2.1-Lon轉染的MCF7細胞，Lon mRNA和蛋白水平均明顯降低；同時形態(tài)學觀察發(fā)現凋亡細胞大量增加；細胞培養(yǎng)結果顯示，細胞增殖能力明顯減弱。紫外線照射和順鉑處理后的MTT結果顯示pSilencer

4、U6 2.1-Lon轉染組的細胞，增殖能力明顯下降，與空載體轉染組相比有顯著性差異(P<0.05)，空載體轉染組與未轉染組相比無顯著性差異(P>0.05)。加熱應激試驗顯示，41℃處理后，RNA干擾轉染組(pSilencer U6 2.1-Lon)與空載體轉染組(pSilencer U6 2.1)相比有顯著性差異(P<0.05)；而在43℃、45℃，pSilencer U6 2.1-Lon轉染組、空載體轉染組和未轉染組之間無顯著性差異(

5、P>0.05)。流式細胞術檢測在細胞周期中，pSilencer U6 2.1-Lon組的細胞處于G0/G1期的細胞增多，同時S期的細胞比例減少，而另兩組細胞無此改變；細胞凋亡率pSilencer U6 2.1-Lon質粒組為22.47％±3.15％，與空載體轉染組2.3％±0.9％和無質粒轉染組1.14％±0.79％比較有明顯提高，而空載體轉染組和無質粒轉染組相比無明顯差異；經順鉑處理后pSilencer U6 2.1-Lon質粒組的凋