G蛋白偶聯(lián)受體激酶4對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞AT1受體的異常調(diào)節(jié)在原發(fā)性高血壓中的研究.pdf

1、一．研究背景
　　原發(fā)性高血壓(essential hypertension EH)是多種心腦血管疾病的重要病因及危險(xiǎn)因素，高血壓的發(fā)生除與中樞調(diào)節(jié)和腎臟鈉水潴留有關(guān)以外，血管的異常增殖也發(fā)揮了重要的作用，其中血管平滑肌細(xì)胞( vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的合成是高血壓發(fā)生、發(fā)展的重要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin II，Ang II)通過與血管

2、緊張素Ⅱ1型受體（Angiotensin II type1 receptor，AT1）結(jié)合刺激VSMCs增殖，在高血壓的血管重構(gòu)中占據(jù)了重要的地位；此外 Ang II亦可促進(jìn)血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)的合成和釋放，促使兒茶酚胺異常釋放從而增加交感神經(jīng)活性；此外亦可通過促使腎臟水

3、、鈉潴留、刺激血管收縮致血管阻力增加等參與機(jī)體血壓水平的調(diào)控。
　　GRKs是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，共有7個(gè)類型(GRK1～7)，幾種亞型中，只有GRK4的活性改變先于高血壓的發(fā)生而發(fā)生。EH患者或高血壓大鼠血淋巴細(xì)胞 GRK2和GRK5表達(dá)和活性也升高，但這種變化僅是EH的一種繼發(fā)改變。人體中GRK4基因所在的染色體部位(4p16.3)與EH基因連鎖，至今發(fā)現(xiàn)的位于GRK4γ亞單位的3個(gè)SNP位點(diǎn)R65L、A142V、A4

4、86V可以顯著增加GRK4活性。GRK4 A142V轉(zhuǎn)基因小鼠正常鹽飲食情況下血壓顯著升高的同時(shí)腎臟AT1蛋白表達(dá)增加，給予GRK4 A142V轉(zhuǎn)基因小鼠腎動(dòng)脈AngⅡ灌注后發(fā)現(xiàn)，其收縮壓明顯高于野生型對(duì)照小鼠；給予AT1受體拮抗劑干預(yù)，GRK4 A142V轉(zhuǎn)基因小鼠的血壓也明顯下降，提示GRK4可能是高血壓狀態(tài)下腎臟AT1受體功能增強(qiáng)的重要調(diào)節(jié)因子。但GRK4在血管組織是否亦發(fā)揮對(duì)AT1受體的調(diào)節(jié)作用目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們?cè)谇捌谘芯?/p>

5、發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞存在GRK4蛋白表達(dá)，因此，本課題擬利用大鼠胚胎鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞株(A10細(xì)胞株)為研究對(duì)象，抑制或過表達(dá)GRK4活性，分析其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞AT1受體的表達(dá)和功能的影響，探討GRK4對(duì)AT1受體的調(diào)節(jié)機(jī)制或關(guān)鍵靶點(diǎn)，為預(yù)防高血壓并發(fā)癥的發(fā)生提供理論依據(jù)。
　　一．研究目的
　　明確GRK4受體對(duì)血管平滑肌細(xì)胞AT1受體的表達(dá)以及功能的影響，探討該調(diào)節(jié)作用與高血壓血管異常增殖之間的關(guān)系。
　　

6、二．研究?jī)?nèi)容
　　1.驗(yàn)證GRK4在血管平滑肌上表達(dá)，觀察GRK4對(duì)AT1受體表達(dá)及磷酸化的影響；
　　2. GRK4突變體A142V( hGRK4γA142V)轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)一步分析對(duì)AT1受體蛋白表達(dá)、磷酸化影響及潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　3.GRK4野生型和突變體轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，研究其對(duì)Ang II致血管平滑肌細(xì)胞促增殖影響，探討GRK4參與血管異常增殖調(diào)節(jié)的機(jī)理。
　　三、研究方法
　　1.

7、免疫組化驗(yàn)證大鼠腸系膜動(dòng)脈組織GRK4蛋白表達(dá)。
　　2.以大鼠胚胎鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(A10細(xì)胞)為研究對(duì)象，siRNA沉默GRK4蛋白表達(dá)后，Werstern blot方法觀察對(duì) AT1受體蛋白表達(dá)；磷酸化絲氨酸免疫沉淀法分析AT1受體磷酸化改變；
　　3.慢病毒包裹人 GRK4野生型(hGRK4γWT)和突變體 A142V( hGRK4γA142V)轉(zhuǎn)染A10細(xì)胞，測(cè)定GRK4活性的變化、Werstern blo

8、t分析AT1受體表達(dá)及磷酸化絲氨酸免疫沉淀法分析AT1受體磷酸化改變；
　　4.免疫沉淀分析GRK4和AT1物理共連接；
　　5.[3H]胸腺嘧啶摻入法測(cè)定GRK4對(duì)AngⅡ促血管平滑肌細(xì)胞增殖變化。
　　四．研究結(jié)果
　　1.GRK4在大鼠腸系膜動(dòng)脈肌層組織有豐富表達(dá)；
　　2．大鼠特異性GRK4 siRNA轉(zhuǎn)染A10細(xì)胞，GRK4蛋白表達(dá)和AT1受體表達(dá)降低、AT1受體磷酸化增加；
　　3．hGR