廣東省食品中單增李斯特菌的污染狀況及其PFGE分子分型研究.pdf

1、食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質基礎。近年來，在世界范圍內食品安全方面的惡性和突發(fā)事件屢屢發(fā)生。李斯特菌病已成為全球性食源性疾病之一，在國際上受到高度重視。因此，對該病的病原學研究十分重要。 研究目的 1.從食物種類、時間、地點三個方面分析廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的污染狀況及其流行趨勢。 2.應用PFGE對單增李斯特菌進行分子分型，分析廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的分子流行病學特征。

2、3.建立食品中單增李斯特菌的PFGE數據庫。 研究方法 1.單增李斯特菌的檢驗 1.1樣品來源 1.1.1采樣時間：在2002年至2005年四年期間，根據廣東省的特殊氣候，每個采樣點分春冬和夏秋各采樣一次。 1.1.2采樣地點：為了使采集的樣品達到較好的均衡性和全面性，在地理分布上兼顧了全省的東南西北部，選取地點有山區(qū)、平原和沿海地區(qū)，既有經濟發(fā)達的地區(qū)，也有經濟相對落后的地區(qū)，這樣采集的樣品能真

3、實地反映廣東省食品的污染情況。選取的地點有韶關(包括仁化和始興)、湛江、深圳、廣州(包括增城和番禺)、汕頭(澄海)和海豐；從2004年開始增加了肇慶、東莞、珠海、江門和中山共11個監(jiān)測點。 1.1.3樣品種類和數量：采集的食品有生肉(雞、豬、牛和羊)，無定型包裝熟肉、生牛奶、酸奶、冰淇淋、水產品和蔬菜，每年檢測樣品400～600份。后來增加的5個監(jiān)測點由地方疾病預防控制中心每年采樣并檢測80份樣品，陽性菌株上送廣東省疾病預防控制

4、中心。 1.2檢驗方法： 參照全國食源性致病菌檢測工作手冊和GB／T 4789.30-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》方法進行檢測，獲得陽性菌株，并保存菌種。 1.3數據分析： 應用統(tǒng)計軟件SPSS11.0進行數據分析及繪制統(tǒng)計圖。 2．單增李斯特菌PFGE分子分型方法的建立 2.1 PFGE原理： 將細菌包埋于瓊脂凝膠塊中，用溶菌酶和蛋白酶K將細菌菌體

5、和蛋白質消化，釋放出完整的細菌染色體DNA，再用適當的限制性內切酶在原位對整個細菌染色體DNA進行酶切，酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過電場方向不斷交替變換及合適的脈沖時間等條件下而得到良好的分離。 2.2 PFGE方法： 參照美國PulseNet的單增李斯特菌PFGE分子分型標準方法進行檢測，并根據實際情況進行實驗條件的優(yōu)化。 2.3數據分析： 采用比利時Applid Maths公司的BioNumeric

6、s關系數據庫軟件進行圖像分析，建立數據庫，進行比對和相應分析。 研究結果 1.廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的污染狀況 本研究從2002年-2005年一共檢測了2100份食品，其中有90份樣品檢出單增李斯特菌，陽性率為4.29％。按檢出單增李斯特菌陽性率由高到低排列：生雞肉為7.90％、生羊肉為7.46％、熟肉制品為7.21％、生牛肉為4.17％、生豬肉為3.42％、水產品為3.18％、色拉為2.61％、蔬菜

7、為1.28％、冰淇淋和生牛奶為0。 廣東省的氣候比較特殊，每年7-9月是廣東省最熱的季節(jié)，但檢出率卻最低為3.58％，1-3月是廣東省最冷的季節(jié)，檢出率卻最高為11.21％。2002年-2005年檢出率分別為1.57％、3.77％、8.68％和3.16％，檢出率從2002年逐年上升至2004年達高峰，2005年回落。 2002年-2005年韶關檢出單增李斯特菌陽性率最高為9.22％，依次為汕頭5.43％、深圳5.03％、

8、廣州4.67％、湛江1.95％。 2．PFGE方法建立與實驗條件優(yōu)化 根據PFGE實驗條件優(yōu)化結果，把細菌菌懸液的濁度調整為0.85-0.90，比標準方法的0.79-0.82要高，因為菌含量越高，DNA的含量也會越高，電泳出來的圖譜DNA的亮度也會相應變強。由于細胞裂解2小時的DNA圖譜比細胞裂解3小時的圖譜缺失了分子量最大的1條DNA片段，故把細胞裂解時間2小時改為3小時。對于21cm×14cm的膠，電泳時間21小時會

9、使H9812最小分子量的DNA片段跑到膠的底部，超出要求范圍(距膠的邊緣1.0-1.5am)之外，故把電泳時間從21小時改為20小時。其余條件不變。 3．應用PFGE方法，分析廣東省有代表性的食品中單增李斯特菌的分子流行病學特征 食物種類、采樣時間和采樣地點相同，單增李斯特菌出現相同的PFGE圖譜，并且相似值為100％，為同一基因分型，說明這些分離株具有極高的同源性。 若食物種類、采樣時間和采樣地點都不相同，單增

10、李斯特菌出現相同的PFGE圖譜，為同一基因分型，說明這些分離株親緣關系很近。 韶關(仁化、始興)、惠州、汕頭(澄海)和湛江各自有本地區(qū)特有的PFGE圖譜，提示為有本地區(qū)特有的分離株。廣州(番禺、增城)、深圳、中山、肇慶和珠海沒有本地區(qū)特有的PFGE圖譜，佛山、海豐和揭陽各檢出1株單增李斯特菌，各自獨立分為1個型。 4．單增李斯特菌PFGE數據庫的建立 應用PFGE方法對107株(其中90株為本實驗室監(jiān)測所得，17

11、株為地方疾病預防控制中心上送菌株)分離自廣東省食品中的單增李斯特菌進行分子分型，用AscI限制性內切酶進行酶切，可產生8-14條DNA片段，分子量大小在20kb—1100kb之間。用BioNtimerics V4.0軟件對數據進行聚類分析，根據電泳產生條帶的位置和數量的不同，共分為41個不同的型別，相似值在54.4％-100％。這些實驗菌株表現出較大的遺傳多樣性。 結論 1.廣東省食品存在單增李斯特菌的污染，20

12、02年-2005年單增李斯特菌的陽性率為4.29％。在生雞肉、生羊肉、生牛肉、生豬肉、熟肉制品、水產品、色拉和蔬菜等大多數食品中均可檢出該菌。檢出率從2002年開始逐年上升，至2004年達高峰，2005年回落。其中韶關地區(qū)食品中單增李斯特菌的陽性率最高，表明邊遠山區(qū)單增李斯特菌污染食品的機會較多。 2.首次應用PFGE方法對107株分離自廣東省食品中的單增李斯特菌進行分子分型，共分為41個不同的型別，這些實驗菌株在整體上表現出較