五味子乙素預(yù)防BaP致HTR8-SV neo細(xì)胞凋亡損傷的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴是常見的空氣污染物，苯并(a)芘(BaP)是多環(huán)芳烴中最有代表性的污染物，主要來自于煤炭燃燒、煙草煙霧、烹調(diào)油煙和汽車尾氣，容易在土壤、水體和作物中殘留蓄積[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，苯并(a)芘與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生有關(guān)，如流產(chǎn)、低出生體重及畸形等，還和生育能力下降、不孕不育有關(guān)[2-5]，其可能的作用機制包括參與氧化損傷、DNA損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞色素P450酶的代謝及抗雌激素效應(yīng)等[6-11]。
　　五味子（北五味子）屬于木蘭

2、科植物，具有滋腎、止瀉、斂肺、寧心、澀精、安神等功效，其主要成分五味子乙素不僅具有抗氧化和抗凋亡功能[12-15]，還具有體外抑菌[16]，抗腫瘤[17-18]，抗DNA損傷[19]等作用。但五味子乙素在空氣污染物致胚胎損傷的預(yù)防作用方面的研究尚未見報道。本實驗通過構(gòu)建苯并芘(BaP)損傷人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)HTR8-SVneo模型，探討五味子乙素預(yù)防BaP致HTR8-SVneo細(xì)胞凋亡損傷的作用。
　　目的:研究五味子乙素通過抗調(diào)

3、亡途徑預(yù)防苯并(a)芘(bap)對人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞的損傷作用，為將其開發(fā)為環(huán)境污染物生殖毒性的保護劑提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、構(gòu)建細(xì)胞模型: MTS法分別檢測五味子乙素、 BaP對人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長曲線影響，研究發(fā)現(xiàn)1～20μmol/L BaP作用24h均可使細(xì)胞生存率下降，且細(xì)胞生存率隨著BaP作用濃度的加大而下降，根據(jù)細(xì)胞生存率和染毒強度，選擇細(xì)胞抑制率在30％左右、染毒強度20μmol/

4、L、作用24小時構(gòu)建的BaP損傷模型。1～2μmol/L的五味子乙素，作用24小時后對細(xì)胞有保護作用，而10～200μmol/L對細(xì)胞有損傷作用，據(jù)此實驗分組:空白組、BaP（20μmol/L）染毒組、五味子乙素(0.5、1、2μmol/L)+Bap（20μmol/L）染毒組。
　　2、采用Hoechst33342熒光雙染技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)分別觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞的凋亡率，JC-1熒光探針法檢測細(xì)胞的線粒體膜電位變化。

5、>　　3、ELISA法分別檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C、Bax、Bcl-2的蛋白濃度，Western-blot法分別檢測細(xì)胞的Caspase3，Caspase9蛋白量的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、五味子乙素對BaP損傷的保護作用
　　MTS法發(fā)現(xiàn)，空白對照組OD值為1.568±0.012，BaP染毒組為1.187±0.015，0.5μmol/L五味子乙素為1.483±0.022，1μmol/L五味子乙素為1.489±0.048

6、，2μmol/L五味子乙素為1.531±0.240，與BaP染毒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、五味子乙素對BaP損傷模型中細(xì)胞凋亡情況的影響
　　實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以降低BaP對人絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡損傷。Hoechst33342染色實驗結(jié)果觀察到BaP損傷模型中出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，用流式細(xì)胞儀檢測每組細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)不同濃度的五味子乙素預(yù)處理24h可降低BaP損傷模型細(xì)胞凋亡率，空白

7、對照組凋亡率為0.031±0.001，BaP染毒組為0.123±0.04，0.5μmol/L五味子乙素為0.064±0.008，1μmol/L五味子乙素為0.052±0.020，2μmol/L五味子乙素為0.036±0.014，與BaP染毒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、五味子乙素對BaP損傷模型中線粒體膜電位變化的影響
　　結(jié)果表明不同濃度的五味子乙素預(yù)處理24h后可降低BaP損傷模型細(xì)胞的線粒體膜電位

8、變化，空白對照組紅/綠熒光強度為10.20±2.37，BaP染毒組為3.35±0.85，0.5μmol/L五味子乙素為6.99±0.53，1μmol/L五味子乙素為7.15±1.22，2μmol/L五味子乙素為8.73±1.05，與BaP染毒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、五味子乙素對BaP損傷模型中細(xì)胞色素C，bax，bcl-2蛋白濃度的影響
　　ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)0.5、1、2μmol/L的五味子乙

9、素預(yù)處理24h后可使BaP損傷模型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C，bax濃度降低，bcl-2濃度升高，與BaP染毒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、五味子乙素對BaP損傷模型中caspase3，caspase9表達(dá)的影響
　　Western-blot法檢測0.5、1、2μmol/L的五味子乙素預(yù)處理24h后可降低BaP損傷模型細(xì)胞caspase3，caspase9的表達(dá)，與BaP染毒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05

10、)。
　　結(jié)論:
　　本研究從線粒體凋亡的信號通路層面探討了五味子乙素對Bap所致HTR8-SVneo細(xì)胞凋亡損傷可能的預(yù)防作用及部分機制，發(fā)現(xiàn)五味子乙素可以通過降低細(xì)胞內(nèi)bax蛋白的濃度、升高bcl-2蛋白的濃度，使線粒體膜電位的丟失減少，阻礙細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，進而抑制下游凋亡信號Caspase-9、Caspase-3表達(dá)，從而達(dá)到抗凋亡作用。
　　因此，我們認(rèn)為五味子乙素可以預(yù)防苯并芘造成的人絨毛膜外滋