五味子乙素預(yù)防BaP致HTR-8-SV neo細(xì)胞氧化損傷及DNA損傷的研究.pdf

1、目的:探討五味子乙素對BaP致HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化損傷及DNA損傷的預(yù)防作用，并初步研究其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、建立體外BaP損傷模型及測定不同濃度五味子乙素的保護(hù)作用:實驗分組:對照組、BaP染毒組、BaP染毒+不同劑量的五味子乙素(0.1、0.5、2μmol/L)組。用MTS法測定細(xì)胞存活率。
　　2、氧化系統(tǒng)物質(zhì)的分析:測定相關(guān)氧化物質(zhì)，活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(L

2、DH)的含量變化及一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)系統(tǒng)中一氧化氮(NO)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、總一氧化氮合酶(TNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的含量變化。
　　3、抗氧化系統(tǒng)物質(zhì)的分析:測定抗氧化相關(guān)酶，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的含量變化。
　　4、DNA氧化損傷程度的評價:通過彗星實驗（單細(xì)胞凝膠電泳）測定細(xì)胞DNA損傷程度;利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢

3、測細(xì)胞外液中DNA氧化損傷標(biāo)記物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。
　　5、DNA氧化損傷修復(fù)的評價:半定量PCR(RT-PCR)及實時定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分別檢測堿基切除修復(fù)途徑相關(guān)基因人X射線修復(fù)交差互補(bǔ)組1(XRCC1)、人多聚ADP核糖聚合酶（PARP1）、人8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)基因的表達(dá)水平，ELISA法檢測XRCC1、PARP1蛋白表達(dá)量和免疫印跡法(westernblotting)

4、檢測人8-羥基鳥嘌呤DNA糖菅酶OGG1蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、五味子乙素對BaP致HTR-8/SVneo細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　經(jīng)MTS法檢測。根據(jù)染毒強(qiáng)度和細(xì)胞存活率狀況，選定染毒濃度為20μmol/l BaP作用24小時，建立BaP損傷模型，同時選定五味子乙素濃度為0.1、0.5、2μmol/l。研究發(fā)現(xiàn):與BaP組相比，不同劑量五味子乙素組能顯著降低BaP對HTR-8/SVneo細(xì)胞的殺傷作用，提高細(xì)

5、胞的存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、五味子乙素對BaP損傷模型中氧化物質(zhì)的影響
　　與對照組比較，BaP組細(xì)胞ROS、LDH、MDA的表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞NOS/NO系統(tǒng)中TNOS、iNOS、eNOS活性增強(qiáng)，NO表達(dá)量增加(P＜0.05)。而不同劑量的五味子乙素組與BaP組相比，細(xì)胞ROS、LDH、MDA含量均有不同程度的減少，細(xì)胞NOS/NO系統(tǒng)中TNOS、iNOS、eNOS活性降低，NO含量減少(P

6、＜0.05)。
　　3、五味子乙素對BaP損傷模型中抗氧化系統(tǒng)的影響
　　與對照組比較，BaP組細(xì)胞SOD、GSH-Px的活性下降(P＜0.05)，而不同劑量的五味子乙素組與BaP組相比，細(xì)胞SOD、GSH-Px的活性顯著提高(P＜0.05)。
　　4、五味子已素對BaP損傷模型中DNA損傷的影響
　　與對照組比較，BaP組細(xì)胞培養(yǎng)液中8-OHdG的表達(dá)量顯著升高，同時彗星實驗表明細(xì)胞DNA損傷程度顯著增加，其O

7、 Live尾距、尾長及尾部DNA％含量增加，頭部DNA％含量減少(P＜0.05)。而五味子乙素提前干預(yù)后，明顯抵抗了因BaP誘導(dǎo)的8-OHdG含量的升高，同時DNA損傷程度也明顯減輕，其O Live尾距、尾長、尾部DNA％顯著低于BaP組，而頭部DNA％高于BaP組(P＜0.05)。
　　5、五味子乙素對BaP損傷模型中DNA損傷修復(fù)的影響
　　與對照組比較，BaP組堿基切除修復(fù)途徑相關(guān)因子XRCC1、PARP1、OGG1基

8、因及蛋白的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。而不同劑量的五味子乙素組與BaP組相比，XRCC1、PARP1、OGG1基因及蛋白的表達(dá)量顯著提高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、BaP可引起細(xì)胞氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡，誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化水平升高以及抗氧化能力減弱。而五味子乙素可通過提高氧化酶SOD、GSH-Px的活性，減少自由基的生成量，降低NOS酶的活性，減少NO的含量，維持NOS/NO系統(tǒng)的平穩(wěn)，糾正細(xì)胞