FITC及Gd-DTPA標記的可活化穿膜肽在人肝內(nèi)膽管上皮細胞中的作用研究.pdf

1、目的：通過利用可活化穿膜肽的特性將熒光標記物及磁共振對比劑帶入人肝內(nèi)膽管上皮細胞，借此研究肝內(nèi)膽管上皮細胞在膽管病中的變化，探討在肝膽管病中體外監(jiān)測膽管上皮細胞變化及藥物靶向定位的可行性，為臨床上治療膽管病以新的思路，提高膽管病的治療效果。
　　方法：
　　一、穿膜肽的合成及標記：可活化穿膜肽（EEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRR-Ahx-k）由上海淘普生物科技有限公司利用用固相法化學(xué)合成，并在其N端分別標記FI

2、TC及Gd-DTPA。
　　二、熒光顯微鏡分析：培養(yǎng)正常人肝內(nèi)膽管上皮細胞（human intrahepatic bile duct epithelial cells，hIBDEC），培養(yǎng)成功后分別用含有2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后再將每組分別用25umol?L-1、50umol?L-1、100umol?L-1、150umol?L-1標記有FITC的A

3、CPP(FITC-ACPP)孵育2h，觀察上訴各組細胞及無ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h組與無LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h組內(nèi)的熒光表達情況，選擇出LPS的刺激濃度范圍及最佳的FITC-ACPP作用濃度。
　　三、流式細胞儀檢測：（1）分別用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h。（2）用含

4、有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC，按24h、48h、72h時間梯度培養(yǎng)后，再將其與100 umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP按照1h、2h、4h的時間梯度共孵育，采用流式細胞儀檢測上訴各組細胞內(nèi)的熒光強度值。
　　四、磁共振成像研究：（1）分別用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml

5、的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的標記有Gd-DTPA的ACPP（Gd-DTPA-ACPP）共孵育2h。（2）用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC，按24h、48h、72h時間梯度培養(yǎng)后，再將其與100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h。（3）用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)hIBDEC72h，再將其與100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP按照1h、2h、4

6、h的時間梯度共孵育，采用磁共振成像儀檢測上訴各組細胞及空白細胞組、無LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h組細胞內(nèi)的平均信號強度值。并采用視覺評價法分析各組細胞內(nèi)的磁共振信號變化特征。
　　五、統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。組與組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　一、熒光顯微鏡檢測見無ACPP孵育有LPS

7、刺激24h有FITC共孵育2h組及無LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h組細胞內(nèi)均未見熒光反應(yīng),其余各組均可見熒光反應(yīng)。同一FITC-ACPP濃度孵育及孵育時間、不同LPS刺激濃度的細胞相比，10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml組熒光肉眼觀無明顯差異。20μg/ml LPS刺激濃度下細胞不能貼壁，未到24h細胞碎裂死亡，15μg/ml LPS刺激濃度組雖未碎裂死亡，但僅有少量細胞存活，F(xiàn)ITC-ACPP孵育后沖洗細胞爬片時細胞

8、脫離載玻片，故20μg/ml與15μg/ml LPS刺激濃度組未能進行熒光顯微鏡拍照；同一LPS刺激濃度、不同F(xiàn)ITC-ACPP濃度孵育的細胞相比，肉眼觀25umol?L-1與50umol?L-1組較100umol?L-1與150umol?L-1弱、100umol?L-1與150umol?L-1組無明顯差異，故選擇100umol?L-1的FITC-ACPP為實驗濃度。
　　二、流式細胞儀檢測見：（1）在5μg/ml LPS刺激濃度

9、刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育的條件下，隨著FITC-ACPP孵育時間的增加（1h、2h、4h），平均熒光強度值逐漸增加，并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（2）在5μg/ml LPS刺激濃度刺激、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h的條件下，隨著LPS刺激時間的增加（24h、48h、72h），平均熒光強度值逐漸增加，并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（3）在不同濃度的LPS刺激72h、100u

10、mol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h的條件下，隨著LPS濃度的增加（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml），平均熒光強度值雖有不同，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　三、磁共振成像研究示：（1）在5μg/ml LPS刺激濃度刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育的條件下，隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時間的增加（1h、2h、4h），平均磁共振信號強度值逐漸增加，并有統(tǒng)計學(xué)意義（P

11、<0.05），視覺評價法亦能發(fā)現(xiàn)隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時間的增加，各組細胞間的磁共振信號強度逐漸增強。（2）在5μg/ml LPS刺激濃度刺激、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h的條件下，隨著LPS刺激時間的增加（24h、48h、72h），平均磁共振信號強度值逐漸增加，并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），視覺評價法亦能發(fā)現(xiàn)隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時間的增加，各組細胞間的磁共振信號強度逐漸增強。（3）

12、在不同濃度的LPS刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育2h的條件下，隨著LPS濃度的增加（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml），平均磁共振信號強度值雖有不同，但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），視覺評價法亦未能發(fā)現(xiàn)差異。上訴各組細胞內(nèi)的磁共振信號強度值均較空白細胞組及無LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h組強，并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：標記有FITC及Gd-DT