Metformin以AMPK非依賴的方式下調(diào)DAPK抑制槲皮素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬.pdf

1、[目的]
　　 Metformin作為一種有效的雙胍類降糖藥物，數(shù)十年來(lái)在全球被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。近期多個(gè)系列的研究發(fā)現(xiàn)，Metformin除了可以治療糖尿病以外還具有潛在的預(yù)防和抵抗癌癥發(fā)生的保護(hù)性功效。與接受其他抗糖尿病藥物治療的患者相比，接受Metformin治療的糖尿病患者罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)最低，最新的糖尿病和腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的研究數(shù)據(jù)證實(shí)，Metformin不僅可以預(yù)防癌癥的發(fā)生，還可以作為一種輔助劑增強(qiáng)化療藥物對(duì)

2、腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。目前，對(duì)于Metformin在糖尿病治療以及癌癥防治中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制，依舊知之甚少。
　　 當(dāng)前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，Metformin通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)一種關(guān)鍵的能量控制蛋白AMP-活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)來(lái)發(fā)揮其藥理作用，對(duì)AMPK之外的其他信號(hào)途徑鮮有報(bào)道。最近的研究已經(jīng)證實(shí)，Metformin對(duì)AMPK的激活必須借助AMPK的上游激酶LKB1的催

3、化作用。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中意外地發(fā)現(xiàn)在LKB1缺失的Hela細(xì)胞系中，Metformin可以在不激活A(yù)MPK的情況下抑制黃酮類藥物槲皮素(Quercetin)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。而自噬本身，作為當(dāng)前癌癥治療領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，有望成為癌癥治療重要靶標(biāo)，因此，槲皮素與Metformin對(duì)Hela細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)和抑制，所涉及的具體分子機(jī)制非常值得進(jìn)一步研究。通過(guò)研究，我們嘗試對(duì)槲皮素和Metformin在疾病治療中的作用機(jī)制提供一些新的解釋，并探討

4、槲皮素和Metformin作為潛在的自噬調(diào)節(jié)劑在腫瘤治療方面的應(yīng)用前景。
　　 [方法]
　　 首先用MTT法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)，確定槲皮素誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬的合適濃度范圍。通過(guò)電鏡檢測(cè)，確認(rèn)經(jīng)25-50μM的槲皮素誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞中出現(xiàn)的囊泡是自噬體。采用MDC染色，熒光顯微鏡觀察不同濃度槲皮素誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬強(qiáng)度以及不同濃度的Metformin對(duì)槲皮素誘導(dǎo)的自噬抑制效果。采用WesternBlot的方法檢測(cè)當(dāng)前最受

5、關(guān)注的兩大自噬相關(guān)信號(hào)途徑：AMPK-mTOR通路和DAPK-Beclin1通路中激酶AMPK和DAPK蛋白及蛋白磷酸化水平在上述的自噬誘導(dǎo)和抑制過(guò)程的變化情況，探索槲皮素和Metformin在自噬誘導(dǎo)和抑制中的具體分子機(jī)制。
　　 [結(jié)果]
　　 MTT和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果表明，25-50μM濃度范圍的槲皮素對(duì)細(xì)胞周期有阻滯作用，但尚未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。透射電鏡結(jié)合MDC染色和熒光顯微鏡觀察，結(jié)果證實(shí)25-50μM

6、的槲皮素可有效誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬。槲皮素誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬強(qiáng)度隨藥物濃度升高而逐漸增加，與之相應(yīng)的分子水平的變化是DAPK Ser308位點(diǎn)去磷酸化現(xiàn)象逐步加劇，這表明槲皮素以濃度依賴性方式逐步增強(qiáng)了DAPK激酶的活性。出乎意料的是，Metformin，這種一直被用作AMPK激活劑的化合物，竟然以AMPK非依賴性的方式顯著下調(diào)DAPK，抑制槲皮素誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞自噬。作為對(duì)照，AMPK的另一激活劑AICAR則無(wú)法發(fā)揮上述功效