HIV-1在不同傳播方式下準(zhǔn)種的差異性研究.pdf

1、研究背景和目的:準(zhǔn)種(quasispecies)是由Eigen首先提出的用于描述同種生物遺傳異質(zhì)性的概念。在病毒學(xué)研究領(lǐng)域，準(zhǔn)種被用于描述感染個(gè)體內(nèi)同種病毒的遺傳異質(zhì)性(geneticheterogeneity)。準(zhǔn)種特性已經(jīng)被證實(shí)是RNA病毒具有的一種普遍的生物學(xué)特性。HIV-1是一種變異活躍的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其逆轉(zhuǎn)錄酶在病毒基因組反向轉(zhuǎn)錄和正向轉(zhuǎn)錄過(guò)程中均缺乏自身校正功能，導(dǎo)致同亞型或不同亞型病毒株間基因片段重組、缺失、重復(fù)或倒置，并且

2、隨流行時(shí)間的延長(zhǎng)，變異程度不斷增大。 構(gòu)象敏感性凝膠電泳(conformationsensitivegelelectrophoresis，CSGE)是一種很好的基因多態(tài)性分析的方法，其實(shí)質(zhì)上是異源雙鏈分析(heteroduplexanalysis，HDA)的改進(jìn)方法。在本研究中，將以往的CSGE的方法做了如下改進(jìn)：①在聚丙烯酰胺凝膠中加入15％尿素；②甲酰胺濃度從15％提高至20％，乙二醇濃度從10％提高至15％；③通過(guò)一次預(yù)電

3、泳優(yōu)選驅(qū)動(dòng)子序列。加入尿素可使條帶更狹窄和更清晰，適當(dāng)增加甲酰胺和乙二醇的濃度，提高了CSGE檢測(cè)的敏感性，通過(guò)一次預(yù)電泳優(yōu)選出的驅(qū)動(dòng)子序列，可以使電泳條帶間距離更大，更容易判讀電泳結(jié)果。因?yàn)槭褂玫腜CR產(chǎn)物未作純化，其中的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)同源和異源雙鏈的形成都有較大的影響，直接造成電泳條帶模糊不清，因此我們對(duì)PCR作了嚴(yán)格的優(yōu)化，最大限度地減少了非特異產(chǎn)物的干擾。 性傳播和垂直傳播是HIV-1重要的傳播方式，HIV-1通過(guò)這2

4、種方式更換宿主。盡管從理論上講新宿主體內(nèi)的HIV-1應(yīng)與傳染源體內(nèi)的HIV-1完全相同，但是已經(jīng)有越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)事實(shí)并非如此。 我利用CSGE的手段對(duì)不同傳播方式即垂直傳播和性傳播感染者體內(nèi)HIV-1準(zhǔn)種進(jìn)行差異性研究，了解HIV-1在傳播過(guò)程中以及在新宿主體內(nèi)免疫壓力下準(zhǔn)種變化，進(jìn)而揭示HIV-1準(zhǔn)種的進(jìn)化規(guī)律，同時(shí)為闡明HIV-1母嬰垂直傳播和性傳播的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。 材料和方法:1.研究對(duì)象：母嬰傳播和性

5、傳播HIV-1感染者的血漿。 2.主要試劑：QIAampViralRNAminikit(Qiagen，美國(guó))；QIAGENOneStepRT-PCRKit(Qiagen，德國(guó))；TA-Cloningkit(Invitrogen，美國(guó))等。 3.方法：血漿中提取HIV-RNA→RT-PCR擴(kuò)增外側(cè)片段(1712bp)→第二輪PCR擴(kuò)增內(nèi)側(cè)片段(762bp)→回收純化內(nèi)側(cè)目的片段→目的片段插入T-載體→載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希

6、菌→陽(yáng)性克隆PCR鑒定→CSGE分析→挑選優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)準(zhǔn)種的克隆測(cè)序→應(yīng)用序列分析軟件分析測(cè)序結(jié)果。 主要結(jié)果:1.自HIV-1母嬰垂直傳播的個(gè)體和性傳播個(gè)體的血漿提取HIV-1RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并行套式PCR，共獲得2組母嬰傳播感染者和1組性傳播感染者的env基因C2-V5片段； 2.含有插入片斷的T載體的感受態(tài)大腸埃希菌于LB平板上生長(zhǎng)大約300個(gè)菌落，藍(lán)白篩選結(jié)果，80％以上為白色菌落即陽(yáng)性克?。?3

7、.陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物與驅(qū)動(dòng)子混合行CSGE，母嬰垂直傳播的個(gè)體間和性傳播個(gè)體間的HIV-1準(zhǔn)種組成存在顯著差異； 4.母嬰垂直傳播的個(gè)體間和性傳播個(gè)體間的優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種和劣勢(shì)準(zhǔn)種的相應(yīng)克隆進(jìn)行測(cè)序，分析核苷酸和氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種和劣勢(shì)準(zhǔn)種的核苷酸序列存在顯著差異； 5.分析env基因V3環(huán)的核苷酸和氨基酸突變位點(diǎn)和突變方式的結(jié)果提示，2組母嬰垂直傳播的個(gè)體間和1組性傳播個(gè)體間核苷酸突變位點(diǎn)和突變方式有顯著差異，1組

8、母嬰垂直傳播的個(gè)體間和1組性傳播個(gè)體間氨基酸突變位點(diǎn)和突變方式有顯著差異，另外1組母嬰傳播的個(gè)體中的母親V3環(huán)起點(diǎn)的核苷酸發(fā)生缺失，無(wú)法正常翻譯。 討論:1.用改進(jìn)的CSGE方案，得到了高質(zhì)量的電泳圖譜，說(shuō)明該方法在準(zhǔn)種實(shí)驗(yàn)研究中可行，尤其適合大于400bp而小于1000bp基因多態(tài)性研究(HDA所研究的DNA片段不能大于400bp)； 2.HIV-1的亞型在垂直傳播過(guò)程中未發(fā)生變化，但準(zhǔn)種在垂直傳播個(gè)體間有顯著差異，從