小鼠股骨去骨髓模型的建立及活性維生素D缺乏對其骨修復影響的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述。
　　第一部分 小鼠股骨去骨髓模型的建立和評價
　　目的:建立小鼠股骨去骨髓模型,全面觀察其膜內成骨愈合過程,為研究不同因素對骨折愈合影響提供可靠的動物模型。
　　方法:將40只6周齡BABL/C小鼠的右側股骨髁間開孔,細針破壞骨髓腔,真空抽出骨髓。運用血清檢測、影像分析、組織染色、組織計量及分子生物學等方法研究小鼠股骨去骨髓后骨愈合過程中骨代謝相關血清離子濃度、骨痂形成及成骨、破骨細胞

2、活動的改變。
　　結果:去骨髓術后第2周,血清鈣、磷離子濃度上升,第3周后下降至之前水平,而血清中PTH濃度變化趨勢則相反;X線、微CT二維重建及骨痂組織切片總膠原染色顯示,術后第1周骨髓腔內可見大量新生骨痂形成,第2周骨痂部分被吸收,第3周大部分已被吸收,殘留骨痂發(fā)生鈣化;骨痂組織切片HE染色顯示成骨細胞占骨痂面積比在術后第1周水平較高,第2周達高峰后下降,ALP染色顯示代表成骨細胞活性的ALP陽性面積術后第1周達高峰后下降,T

3、RAP染色顯示破骨細胞占骨痂面積比術后第2周顯著上升并達高峰后,第3周下降;RT-PCR和Western blot方法檢測骨痂組織基因和蛋白表達同樣顯示:成骨相關的基因和蛋白表達在第1周達高峰,第2、3周逐漸下降,代表破骨活性的RANKL/OPG基因表達比值在第1周最大后降低。結果表明小鼠股骨去骨髓后成骨高峰發(fā)生在術后第1周,隨著破骨細胞主導的骨重建進行,第3周完成髓腔重建,這些結果重現了去骨髓后膜內成骨修復的過程。
　　結論:小

4、鼠股骨去骨髓模型易于操作,可靠穩(wěn)定;骨形成周期短,術后3周完成骨重建,可快速研究骨愈合機制;便于利用包括血清學、影像學、組織學和分子生物學多種方法全面觀察骨修復過程。本實驗利用小鼠去骨髓模型模擬了穩(wěn)定性骨折膜內成骨愈合過程,為今后研究不同機制對膜內成骨修復的影響提供了重要的實驗基礎。
　　第二部分 活性維生素D缺乏對小鼠股骨去骨髓骨修復影響的實驗研究
　　目的:明確活性維生素D缺乏對小鼠股骨去骨髓(bone marrow a

5、blation, BMX)后骨修復的影響。
　　方法:選用6周齡野生型和1α(OH)ase基因敲除(1α(OH)ase-/-)小鼠作為實驗對象,去股骨骨髓制作骨損傷模型?；蚯贸M(KO)作為實驗組,野生組(WT)作為對照組。通過血清檢測的方法觀察兩組小鼠術前及術后第1、2、3周骨代謝相關的血清Ca、P、PTH濃度變化;通過影像學、組織化學的方法觀察兩組小鼠術后1、2、3周骨痂生成、吸收的變化;通過組織學、免疫組織化學和組織計量的

6、方法觀察兩組小鼠術后1、2、3周骨痂中成骨細胞、破骨細胞活動的變化;進一步提取兩組小鼠骨痂組織RNA和蛋白,通過分子生物學的方法觀察活性維生素D缺失對骨形成及骨吸收相關基因和蛋白表達水平的影響。
　　結果:KO組小鼠由于活性維生素D缺乏,繼發(fā)低鈣、低磷及高PTH血癥,并且在制作去骨髓模型及隨后骨修復過程中未改變,兩組小鼠術后第2周都出現血清鈣磷濃度升高,血清PTH濃度降低,第3周恢復到術前的水平。X線攝影、微CT三維重建和總膠原染

7、色均顯示:WT組小鼠第1周髓腔內見大量新生骨痂形成,隨后第2周骨痂部分吸收,第3周大部分被吸收;KO組小鼠第1周髓腔內見大量新生骨痂形成,第2周骨痂繼續(xù)形成并達高峰,第3周髓腔內這些骨痂大部分仍存留并礦化;同時發(fā)現,與WT組小鼠相比,KO組小鼠術后皮質骨變薄,骨痂礦化減少。
　　通過組織學染色、免疫組化、組織計量及分子生物學方法研究發(fā)現:KO組小鼠術后1、2、3周髓腔骨痂成骨細胞數,ALP、I膠原染色陽性面積以及骨痂中ALP、I型

8、膠原、Runx2、骨鈣素(OCN)基因和Runx2、PTHR、胰島素樣生長因子I(IGF-I)蛋白表達均高于同觀察點WT組;TRAP染色破骨細胞面積、RANKL/OPG基因比值低于相同觀察點的WT組,而髓腔骨痂破骨細胞數在術后第2、3周明顯高于WT組。對兩組小鼠皮質骨切片進行ALP、TRAP染色發(fā)現:KO組小鼠術后第1、2、3周皮質骨 ALP染色陽性面積比例及TRAP染色破骨細胞面積比例均顯著高于同觀測點WT組。
　　結論:活性維