高通量低功率氦氖激光照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、低功率激光照射能夠引起多種生物刺激效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖，分化以及細(xì)胞凋亡。然而到目前為止，關(guān)于低功率激光照射，尤其在較高的激光劑量時(shí)引起的細(xì)胞層面的分子機(jī)制還不是很清楚。為了研究高通量低功率激光照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們使用氦氖激光器在633 nm的波長(zhǎng)，80 J/cm2或者120 J/cm2的通量下分別對(duì)人肺腺癌細(xì)胞（human lung adenocarcinoma cells，ASTC-a-1）和猴腎成纖維細(xì)胞（African

2、 green monkey SV40-transformed kidney fibroblast cells，COS-7）進(jìn)行激光照射處理。我們通過(guò)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)分子探針H2DCFDA的氧化產(chǎn)物DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的動(dòng)態(tài)產(chǎn)生過(guò)程。我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)分子探針rhodamine 123的熒光強(qiáng)度變化來(lái)反映線粒體膜電位的變化。通過(guò)使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluoresce

3、nce resonance energy transfer，F(xiàn)RET），我們?cè)诒磉_(dá)SCAT3報(bào)告子的細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測(cè)Caspase-3的活性變化。Caspase-8活性的監(jiān)測(cè)是通過(guò)觀察Bid-CFP熒光報(bào)告子的亞細(xì)胞定位來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在高通量低功率激光照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中（120J/cm2，ASTC-a-1），我們觀測(cè)發(fā)現(xiàn)了以下級(jí)聯(lián)的細(xì)胞事件：（1）激光照射后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平迅速升高，并在60 min之內(nèi)達(dá)到最大值。（2）線粒體膜電位的降低

4、發(fā)生在激光照射后15 min的時(shí)候，并在50 min的時(shí)候達(dá)到最低值。（3）Caspase-3的活化維持在激光照射后30～180 min之內(nèi)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明高通量低功率激光照射不激活死亡受體通路的關(guān)鍵蛋白水解酶Caspase-8，這表明該凋亡過(guò)程直接起始于線粒體ROS的產(chǎn)生和膜電位的降低，不依賴于Caspase-8的活化?？傊?，高通量低功率激光照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通過(guò)觸發(fā)內(nèi)源線粒體途徑，而不是死亡受體途徑。
　　 前面的研究證

5、明高通量低功率激光照射可以通過(guò)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。接下來(lái)我們?cè)贏STC-a-1中研究高通量低功率激光照射（120 J/cm2，633 nm）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中線粒體通路的具體機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)高通量低功率激光照射引起細(xì)胞色素c釋放是由于線觸發(fā)了粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道（mitochondrial permeability transition pores，MPT pores）的長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放所導(dǎo)致的，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)MPT孔道的特異性抑制劑環(huán)

6、孢菌素A（cyclosporine，CsA）阻止了細(xì)胞色素c的釋放。另外，線粒體對(duì)在生理狀態(tài)下線粒體非通透的鈣黃綠素的通透性增加也是高通量低功率激光照射觸發(fā)MPT的另一個(gè)有利證據(jù)。高通量低功率激光照射處理后，細(xì)胞內(nèi)立刻監(jiān)測(cè)到大量的ROS的產(chǎn)生。這種由于激光照射觸發(fā)的光動(dòng)力反應(yīng)的產(chǎn)物ROS能夠觸發(fā)MPT孔道的長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放，因?yàn)镽OS清除劑維生素c阻止了這一過(guò)程。另外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CsA并沒(méi)有完全阻止高通量低功率激光照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，

7、說(shuō)明在該凋亡過(guò)程中存在除了MPT之外其他的信號(hào)通路。我們發(fā)現(xiàn)，激光照射后Bax的活化發(fā)生在線粒體去極化以及細(xì)胞色素c釋放之后，這說(shuō)明Bax的活化是一個(gè)下游的凋亡事件。在CsA存在的情況下，Bax在凋亡的后期仍然被激活，這表明Bax介導(dǎo)的信號(hào)通路不依賴于MPT。在高通量低功率激光照射處理后，維生素c，CsA，以及Bax沉默對(duì)細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)表明MPT介導(dǎo)的信號(hào)通路是主要的，而Bax介導(dǎo)的信號(hào)通路是次要的。值得說(shuō)明的是這兩條信號(hào)通路都是由

8、大量的ROS的產(chǎn)生觸發(fā)的?？傊?，我們的結(jié)果表明高通量低功率激光照射通過(guò)觸發(fā)ROS產(chǎn)生進(jìn)而導(dǎo)致CsA敏感的MPT孔道的長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)，高通量低功率激光照射還誘導(dǎo)了一條由Bax活化介導(dǎo)的次要信號(hào)通路。因此，我們闡明的MPT與ROS之間的關(guān)系是高通量低功率激光照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的基礎(chǔ)。
　　 線粒體是一個(gè)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，它持續(xù)進(jìn)行著分裂和融合兩個(gè)過(guò)程以維持其形態(tài)和功能的完整。然而到目前為止，關(guān)于線粒體融合與分

9、裂的具體機(jī)制還不是很清楚。本文我們還研究了由高通量低功率激光照射觸發(fā)線粒體氧應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體動(dòng)態(tài)變化異常的機(jī)制。在高通量低功率激光照射下，我們發(fā)現(xiàn)線粒體呈現(xiàn)過(guò)度的片段化結(jié)構(gòu)。且該片段化可以被ROS清除劑維生素c所抑制。進(jìn)一步的研究表明，高通量低功率激光照射誘導(dǎo)線粒體片段化是通過(guò)對(duì)融合過(guò)程的抑制和對(duì)分裂過(guò)程的促進(jìn)兩個(gè)方面來(lái)實(shí)現(xiàn)。具體來(lái)說(shuō)，激光照射后，與線粒體穩(wěn)定結(jié)合的促分裂蛋白Drp1（dynamin-related protein 1）

10、大量增加，說(shuō)明高通量低功率激光照射可以激活Drp1。值得說(shuō)明的是，過(guò)表達(dá)Drp1增加了高通量低功率激光照射引起的線粒體片段化的程度并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放加速凋亡過(guò)程。而過(guò)表達(dá)促融合蛋白Mfn2（Mitofusin 2）起到完全相反的效應(yīng)。另外，過(guò)表達(dá)Drp1和Mfn2對(duì)線粒體ROS的產(chǎn)生和線粒體去極化都沒(méi)有影響。因此，高通量低功率激光照射通過(guò)調(diào)節(jié)Drp1和Mfn2的活性進(jìn)而打破線粒體分裂/融合的平衡，最終導(dǎo)致線粒體片段化以及線粒體與

11、細(xì)胞功能的異常。
　　 總之，我們深入研究了高通量低功率激光照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體凋亡途徑的具體分子機(jī)制：激光通過(guò)選擇性激發(fā)線粒體內(nèi)源光敏分子而導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生。線粒體內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生首先造成了線粒體內(nèi)膜MPT孔道的長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜的通透化以及后序的外膜通透化。促凋亡因子如細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中會(huì)導(dǎo)致下游Caspase-3的活化，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外線粒體ROS的產(chǎn)生通過(guò)調(diào)節(jié)融合/分裂蛋白的活