DON模擬表位的兩種表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是一種由鐮刀菌產(chǎn)生的霉菌毒素，由于DON對(duì)人及動(dòng)物具有致畸作用、細(xì)胞毒性及免疫毒性等危害，因此其污染對(duì)人類和動(dòng)物的安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。
　　 目前，DON的分析檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、薄層色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。但這些方法都耗時(shí)耗力、操作復(fù)雜。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一種以免疫化學(xué)為

2、基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，它具有靈敏度高、檢測(cè)快速和操作簡(jiǎn)便等特性。但是，常規(guī)ELISA檢測(cè)方法需要使用DON標(biāo)準(zhǔn)品偶聯(lián)載體蛋白制備競(jìng)爭(zhēng)抗原，存在DON標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)成本高和對(duì)檢測(cè)操作人員的健康有害等缺陷。因此，尋求一種能夠代替DON進(jìn)行ELISA檢測(cè)的物質(zhì)顯得非常有必要。DON模擬表位（CMRPWLQ），簡(jiǎn)稱CDON，能夠替代天然抗原與抗DON抗體相結(jié)合，且DON模擬表位具有無(wú)毒及廉價(jià)等特性。因此，DON模擬表位的高效表達(dá)給以上問(wèn)題提供了一條新的解

3、決途徑。本研究構(gòu)建了兩種表達(dá)載體，并以之表達(dá)了二種CDON的融合蛋白，使用ELISA方法檢測(cè)兩種融合蛋白的反應(yīng)原性，建立了DON的無(wú)毒ELISA檢測(cè)方法。主要結(jié)果如下:
　　 1.將含有DON模擬表位(CMRPWLQ)及BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的T11T12寡核苷酸雙鏈克隆至pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建出了pGEX-4T-1-CDON重組質(zhì)粒。將含有DON模擬表位（CMRPWLQ）及BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的T13T1

4、4寡核苷酸雙鏈克隆至pC89S4噬菌粒，構(gòu)建出了重組噬菌粒pC89S4-CDON。
　　 2.將pGEX-4T-1-CDON轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)，得到工程菌pGEX-4T-1-cdon，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、加入IPTG時(shí)菌體濃度及IPTG的量進(jìn)行了優(yōu)化。得出最優(yōu)條件為當(dāng)菌體濃度達(dá)到0.6時(shí)加入IPTG至終濃度為1mM，于25℃誘導(dǎo)表達(dá)6h。超聲破碎菌體，利用GST-resin純化系統(tǒng)得到97％純度的融合蛋白。
　　

5、 3.將pC89S4-CDON轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue，得到工程菌pC89S4-cdon。通過(guò)絲狀噬菌體pⅧ展示系統(tǒng)表達(dá)出了展示有高密度DON模擬表位的重組噬菌體，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、輔助噬菌體KM13超感染是菌體濃度、加入IPTG時(shí)菌體濃度及IPTG的量進(jìn)行優(yōu)化。噬菌體展示DON模擬表位融合蛋白pⅧ-CDON的最佳條件為:當(dāng)菌體濃度達(dá)到0.3時(shí)加入KM13超感染，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM，于25℃