人類上皮性卵巢癌細胞培養(yǎng)上清誘導CD4+CD25-CD45RA+初始T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分:
　　 目的：研究CD4+CD25-CD45RA+初始T細胞和CD4+CD25-CD45RA-T細胞群體靜息及激活狀態(tài)下叉頭框蛋白3(FOXP3)的表達，以探討不同群體細胞的可能性質(zhì)及同調(diào)節(jié)性T細胞的內(nèi)在聯(lián)系。
　　 方法：采用磁珠分選人外周血淋巴細胞，使用CD4T細胞磁選分離試劑盒、CD25磁珠及CD45RA磁珠分離CD4+T淋巴細胞、CD4+CD25+T淋巴細胞、 CD4+

2、CD25-CD45RA+T淋巴細胞及CD4+CD25-CD45RA-T淋巴細胞，采用流式細胞儀檢測其純度，并使用流式細胞儀檢測其FOXP3的表達。然后使用 CD3/CD28雙信號分別激活CD4+CD25-CD45RA+T淋巴細胞及CD4+CD25-CD45RA-T淋巴細胞3天，流式細胞儀檢測激活后的細胞FOXP3表達。
　　 結(jié)果：靜息狀態(tài)下的CD4+CD25-CD45RA+初始T細胞不表達FOXP3，即使使用CD3/CD28雙

3、信號激活后也很少細胞表達FOXP3，而CD4+CD25-CD45RA-T細胞在靜息狀態(tài)下少量細胞表達FOXP3，但是一旦激活，則高比例的細胞表達FOXP3。
　　 結(jié)論：不同亞型的T細胞具有不同的FOXP3表達模式，特別是在激活狀態(tài)下有明顯的區(qū)別。CD4+CD25-CD45RA+T細胞在未激活時不表達FOXP3，CD3/CD28雙信號刺激3天僅很少量的細胞表達FOXP3，適合作為調(diào)節(jié)性T細胞體外誘導實驗的靶細胞。
　　

4、第二部分：
　　 目的：研究激活后的CD4+CD25-CD45RA-T細胞的表型特征及功能，以明確激活的CD4+CD25-CD45RA-T細胞是否有調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能及其抑制功能的變化。
　　 方法：采用磁珠分選人外周血淋巴細胞，首先采用陰性分選分離CD4+T淋巴細胞，然后使用CD25磁珠去除CD4+CD25+T淋巴細胞，而CD4+CD25-T淋巴細胞再使用CD45RA磁珠分離部分CD4+CD25-CD45RA+T淋

5、巴細胞，剩下的細胞作為CD4+CD25-CD45RA-T細胞分別采用各種方式進行激活，激活后的細胞使用流式細胞儀檢測其FOXP3的表達，然后將其同自身CD4+CD25-CD45RA+T淋巴細胞共培養(yǎng)，使用溴標法檢測其抑制自身CD4+CD25-CD45RA+T淋巴細胞增生的能力。
　　 結(jié)果：不管是否有外源性的IL-2存在，使用CD3/CD28雙信號激活的CD4+CD25-CD45 RA-T細胞都有高比例的細胞表達FOXP3，而且

6、即使是CD3單信號激活，也有高比例的細胞表達FOXP3。中和IL-10及TGF-β并不能抑制其FOXP3的表達。進一步的功能試驗表明，3天激活的CD4+CD25-CD45 RA-T細胞具有抑制功能。但是隨著激活時間的延長，其抑制能力減弱，抑制能力的減弱可能同大量細胞的凋亡有關。
　　 結(jié)論：人類外周血記憶性T細胞群體內(nèi)存在一類調(diào)節(jié)性T細胞的前體細胞，這部分細胞在靜息狀態(tài)下不表達FOXP3，一旦接受TCR信號的激活，特別是有合適的

7、共刺激信號存在的條件下，則快速表達FOXP3并且具有抑制功能，但激活后有快速凋亡的特征。
　　 第三部分：
　　 目的：研究上皮性卵巢癌細胞培養(yǎng)上清是否能夠誘導激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始細胞表達FOXP3并具有抑制功能及其內(nèi)在機制。
　　 方法：采用磁珠分選的方法分離高純度的人類CD4+CD25-CD45RA+初始T細胞，使用CD3/CD28雙信號激活的方法體外激活這些細胞并且在激活的同時在培養(yǎng)

8、基中加入一定比例的上皮性卵巢癌細胞培養(yǎng)上清，共培養(yǎng)3天，激活后的細胞使用流式細胞儀檢測其FOXP3的表達并使用溴標法細胞共培養(yǎng)試驗觀察其抑制功能。我們也在培養(yǎng)系統(tǒng)中分別加入幾種細胞因子的特異性抗體，以觀察其對FOXP3表達的影響。最后我們使用細胞因子模擬或者改變卵巢癌細胞培養(yǎng)上清中細胞因子構(gòu)成的方法觀察其對FOXP3表達的影響。
　　 結(jié)果：我們使用了2個上皮性卵巢癌的細胞株及5個原代培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞，同時使用一個正常的卵

9、巢上皮細胞培養(yǎng)上清作為對照。發(fā)現(xiàn)所有的上皮性卵巢癌細胞培養(yǎng)上清均能誘導激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始細胞表達FOXP3，而正常卵巢上皮細胞培養(yǎng)上清沒有這個能力。隨后的共培養(yǎng)抑制試驗表明這些細胞具有抑制功能。細胞因子中和試驗發(fā)現(xiàn)中和IL-1O及TGF-β及IL-4均不能抑制激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始細胞表達FOXP3，而LIF中和抗體部分抑制其FOXP3表達，但是LIF單獨并不能誘導激活后的CD4+CD25

10、-CD45RA+T初始細胞表達FOXP3。在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入IL-6也不影響卵巢癌細胞上清誘導的FOXP3表達。
　　 結(jié)論：人類上皮性卵巢癌細胞培養(yǎng)上清能夠誘導激活的人類CD4+CD25-CD45RA+初始T細胞表達FOXP3，并具有抑制自身免疫細胞增殖的功能，提示人類上皮性卵巢癌細胞能體外誘導非調(diào)節(jié)性T細胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細胞。改變培養(yǎng)上清中卵巢癌細胞分泌的單一細胞因子水平，不影響人類上皮性卵巢癌細胞誘導激活的人類CD4+CD2