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文檔簡介
1、細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度及其分布的變化代表著某種細(xì)胞功能的啟動、加強(qiáng)和抑制,是形成Ca2+信號的基礎(chǔ)。破譯不同型式的Ca2+信號所代表的生物學(xué)意義,可以大大加深人們對淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識,并進(jìn)一步探索外源性刺激對免疫細(xì)胞鈣信號系統(tǒng)的擾動機(jī)理。
本文運(yùn)用兩種測定胞內(nèi)游離鈣的熒光探針fura-2、fluo-3,以及測定細(xì)胞膜電壓的帶負(fù)電荷類菁熒光染料Bis-oxonol,應(yīng)用熒光光譜儀與激光共聚焦掃描顯微鏡分別在多細(xì)胞和單細(xì)胞
2、兩個層面研究了外源性化學(xué)小分子青霉素G、頭孢哌酮和丙烯酰胺對急性提取的人外周血淋巴細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子信號的影響。選擇肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑(Thapsigargin)、非特異性鈣通道抑制劑La3+、Ni2+、電壓依賴L型鈣通道抑制劑尼卡地平(Nicardipine)、電壓依賴N型鈣通道抑制劑芋螺毒素(ω-conotoxin)和fura-2熒光猝滅劑Mn2+參與外源性小分子對胞內(nèi)游離鈣離子信號的干擾過程,分析了這些外源小分子引發(fā)淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣水
3、平的升高和降低現(xiàn)象的作用機(jī)制。以熒光光譜學(xué)方法對抗生素的用藥安全問題、丙烯酰胺的食品安全問題給出基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時建立了丙烯酰胺SPE-HPLC-UV的檢測方法。
第一章闡述了細(xì)胞鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究動態(tài),簡單介紹了淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子水平的調(diào)控通路,綜述了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測方法的進(jìn)展。
第二章β-內(nèi)酰胺抗生素中的青霉素G不僅臨床應(yīng)用廣泛,而且體外培養(yǎng)細(xì)胞的各種細(xì)胞生理液中均被加入100U/mL的青霉素G以抑制雜菌污染。
4、每公頃農(nóng)業(yè)用土壤中青霉素G殘留含量也超過一千克,這些青霉素G有可能進(jìn)入食物鏈最終影響人體健康。應(yīng)用fura-2熒光探針測鈣技術(shù)研究了擬生理狀態(tài)下低劑量的青霉素G藥物小分子對淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的降低機(jī)制。青霉素G可以激活細(xì)胞膜上的鈣泵,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子外排。細(xì)胞外的鈉、鈣離子濃度的改變協(xié)同影響淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平,低鈉和高鈣的胞外環(huán)境能夠加強(qiáng)青霉素G的排鈣作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了青霉素G能夠抑制鈉鈣交換蛋白的促進(jìn)外鈣內(nèi)流的能力。青霉素
5、G能夠消弱強(qiáng)心劑藥物烏本苷提升胞內(nèi)鈣水平的藥效。
第三章第三代β-內(nèi)酰胺抗生素頭孢哌酮在擬生理狀態(tài)下與低劑量的青霉素G有著相同的排鈣趨勢,強(qiáng)度弱于青霉素G。頭孢哌酮也能夠抑制鈉鈣交換蛋白促進(jìn)的外鈣內(nèi)流,同時低鈉和高鈣的胞外環(huán)境也能夠加強(qiáng)頭孢哌酮的排鈣作用。選擇肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑(Thapsigargin,Tg)和非特異性鈣通道抑制劑La3+、Ni2+參與頭孢哌酮的促進(jìn)內(nèi)鈣外排或抑制外鈣內(nèi)流的降鈣過程中。研究發(fā)現(xiàn)頭孢哌酮有著和非特
6、異性鈣通道抑制劑Ni2+相似的針對該類鈣通道蛋白的作用位點(diǎn)。頭孢哌酮能夠抑制Tg激活的儲池操縱鈣通道(SOC)操縱的胞外鈣離子的內(nèi)流,競爭性結(jié)合SOC通道的鈣結(jié)合位點(diǎn),而且頭孢哌酮對SOC操縱的胞外鈣離子的內(nèi)流的抑制作用是可逆轉(zhuǎn)的。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)了微量青霉素G和頭孢哌酮都能夠?qū)o息狀態(tài)免疫系統(tǒng)開始免疫應(yīng)答所要求的胞內(nèi)游離鈣水平升高產(chǎn)生抑制,發(fā)現(xiàn)血液中微量β-內(nèi)酰胺抗生素的存在能促進(jìn)淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣流失,導(dǎo)致淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣水平降低,延遲
7、淋巴細(xì)胞對抗原的應(yīng)激反應(yīng),擾動免疫系統(tǒng)平衡,從而降低淋巴細(xì)胞的免疫活力。
第四章近年來高溫烘烤煎炸淀粉類食物中所含相應(yīng)劑量的丙烯酰胺的毒性研究成為全球熱點(diǎn)。丙烯酰胺對多細(xì)胞的鈣離子信號的干擾試驗(yàn)表明丙烯酰胺對胞內(nèi)鈣離子濃度變化的擾動表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)內(nèi)鈣增加,高濃度抑制內(nèi)鈣增加。雖然鈣超載與鈣缺乏相互對立,但均由同一刺激引起,只是表現(xiàn)在劑量上、時間上的不同。隨著丙烯酰胺的作用劑量加大,作用時間延長,淋巴細(xì)胞鈣離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制
8、,細(xì)胞內(nèi)游離的總鈣量減少,該作用與細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鉀離子協(xié)同相關(guān),最終導(dǎo)致靜息鈣水平低于正常。單細(xì)胞層面重點(diǎn)論證了淀粉類食品中廣泛存在的低于54μg/mL以下的丙烯酰胺使淋巴細(xì)胞[Ca2+]i迅速升高的作用機(jī)制。低于54μg/mL以下的丙烯酰胺使細(xì)胞[Ca2+]i迅速升高并在400秒之內(nèi)形成較高水平鈣濃度平臺,若無其他干擾,升高的內(nèi)鈣可以在一小時之內(nèi)回復(fù)至初始狀態(tài)。胞外無鈣的外環(huán)境使丙烯酰胺無法誘發(fā)內(nèi)鈣升高。丙烯酰胺不能刺激胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫
9、和線粒體上的鈣池釋鈣,表明受體協(xié)調(diào)的鈣進(jìn)入在此條件下沒有作為。1.0 mM Ni2+的加入將丙烯酰胺誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高降低了35%,丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)Mn2+進(jìn)入淋巴細(xì)胞導(dǎo)致的fura-2熒光促滅,說明丙烯酰胺刺激了非選擇性離子通道的鈣進(jìn)入。電壓依賴鈣通道(VGCC)L型抑制劑尼卡地平對丙烯酰胺的升鈣作用沒有作為,而電壓依賴N型鈣通道抑制劑芋螺毒素使內(nèi)鈣升高明顯降低30%,該結(jié)果表明,丙烯酰胺通過對非選擇性離子通道以及某些N型VGC
10、C的刺激,誘發(fā)內(nèi)鈣升高。丙烯酰胺對淋巴細(xì)胞的[Ca2+]i的干擾與細(xì)胞內(nèi)含量豐富的K+、Na+和Ca2+的協(xié)同作用相關(guān)聯(lián)。另一方面,實(shí)驗(yàn)證實(shí)生理水平存在的維生素C、E能顯著降低丙烯酰胺導(dǎo)致的內(nèi)鈣升高,表明飲食中的抗氧化劑可以降低丙烯酰胺導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。
第五章建立了丙烯酰胺SPE-HPLC-UV的檢測方法。樣品中丙烯酰胺的提取和純化選擇在低溫(0℃)高速離心(13000×g)的條件下。離心過程中通過硬化油脂層并伴隨微孔濾膜過濾
11、,簡單高效的降低了脂類雜質(zhì)的干擾。測試過程中選擇4.0% v/v的乙腈水作為流動相,梯度洗脫程序既能改善色譜柱,又可以將丙烯酰胺從疏水雜質(zhì)中分離出來。工作曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度限定在50-2000μg/L之間,檢測210 nm處吸收強(qiáng)度,校正曲線線性良好,線性系數(shù)R>0.999。在100μg/kg濃度水平的加標(biāo)回收率為78%~107%。檢出限和定量限分別為6和23μg/kg。比LC-MS/MS方法的相應(yīng)數(shù)值稍高,但低于國家監(jiān)控食品中丙烯
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