人AIF C末端截短體分子的基因克隆表達(dá)及對(duì)HeLa細(xì)胞促凋亡活性的研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡（apoptosis）是細(xì)胞受到生理或病理刺激后發(fā)生的自發(fā)性死亡過程。AIF（Apoptosis Inducing Factor，凋亡誘導(dǎo)因子）是1996年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應(yīng)分子。正常情況下，AIF蛋白定位于細(xì)胞線粒體膜間隙，當(dāng)有凋亡信號(hào)刺激時(shí)，AIF分子從線粒體釋放到細(xì)胞漿，再通過其核定位信號(hào)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，直接引起染色體凝集和DNA的大片段（~50kb）斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 AIF的促凋亡活性不受Bcl-2過表達(dá)的影

2、響，也不依賴于caspases的活性，在低等真核細(xì)胞凋亡、以及哺乳類胚胎發(fā)育過程中AIF也具有不可或缺的作用。與caspases等其他凋亡效應(yīng)分子相比，AIF可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生而不受胞漿中其他凋亡抑制因子的抑制， AIF的這一優(yōu)勢(shì)對(duì)于它誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有特殊意義。 Susin等研究發(fā)現(xiàn)，人AIF前體蛋白為67kD，包括以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)域：從氨基端起，（1）氨基端100 aa長度的線粒體定位信號(hào)（MLS）；（2）27aa的Sp

3、acer序列；（3）核定位信號(hào)（NLS）；（4）羧基端485aa的氧化還原酶功能域（129-613位氨基酸）。AIF前體分子在線粒體被切割后，形成成熟的AIF分子，它由三部分構(gòu)成：一個(gè)FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域（122-262aa和400-477aa），一個(gè)NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域（263-399aa）和一個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域（478-610aa）。 本室于翠娟博士成功克隆了成熟型AIF分子（AIFΔ1-120），并且證實(shí)了其促凋亡活性。在此基礎(chǔ)上本

4、室的劉湘麗碩士對(duì)AIF分子進(jìn)行進(jìn)一步截短成功構(gòu)建了四種截短型AIF基因即：AIFΔ1-300(301-613aa)、AIFΔ1-352(353-613aa)、AIFΔ1-400(401-613aa) 、AIFΔ1-480(481-613aa)基因，并證實(shí)這些截短型AIF分子仍具有促凋亡活性，鑒于這些截短型AIF分子仍然存在分子量過大的特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中可能存在困難，我們擬對(duì)AIF分子進(jìn)行進(jìn)一步截短，以期獲得不影響AIF分子促凋亡活性的人

5、AIF C末端截短體分子。 本研究在前期獲得的截短型AIFΔ1-480的基礎(chǔ)上用PCR方法構(gòu)建了人AIF C末端截短體分子AIFΔ1-500(501-613aa)和AIFΔ1-530(531-613aa)，將其作為實(shí)驗(yàn)組基因；同時(shí)構(gòu)建了陰性對(duì)照基因AIF360-480，將人AIF C末端截短體基因及陰性對(duì)照基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3中，經(jīng)DNA測(cè)序，證實(shí)獲得序列正確。將帶有成熟型AIF基因的質(zhì)粒、AIF C末端截短體基因

6、的質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，通過間接免疫熒光證實(shí)C末端截短體分子在細(xì)胞中的表達(dá)。利用熒光顯微鏡可觀察到，人AIF C末端截短體分子表達(dá)于細(xì)胞漿中，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組AIF分子的表達(dá)引起HeLa細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜出泡，細(xì)胞核不均一等凋亡形態(tài)學(xué)變化。 由于人AIF C末端截短體分子的分子量較小，用Western blot不易檢測(cè)到，所以我們將人AIF C末端截短體分子基因與陰性對(duì)照基因均克隆入帶有Flag

7、標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pFlag-CMV4中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，Western blot檢測(cè)其表達(dá)，用激光共聚焦檢測(cè)其細(xì)胞定位，證實(shí)這些C末端截短體分子定位于細(xì)胞漿中。將人AIF C末端截短體分子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，用間接免疫熒光、MTT法、Annexin V分析證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組AIF分子可誘導(dǎo)Cytc的釋放并可抑制HeLa細(xì)胞的增殖。 綜上所述，人AIF C末端截短體分子AIFΔ1-500 及AIFΔ1-530均具有促凋