肝細(xì)胞癌早期發(fā)現(xiàn)多重定量抗體芯片的構(gòu)建及臨床驗(yàn)證.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種進(jìn)展快、預(yù)后差、侵襲性及轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的惡性腫瘤。在全球癌癥病死率中已上升至第3位，在國內(nèi)居第2位。由此可見，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療在肝癌研究中的重要性和迫切性。AFP是目前全世界應(yīng)用最廣泛的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物，但臨床上約40％的肝癌患者血清AFP檢測(cè)為陰性，在妊娠婦女、急慢性肝炎、生殖腺腫瘤和胃腸道腫瘤等人群中也可能升高;而影像學(xué)檢查往往不能成為普查方式，且常在腫

2、瘤長到0.5～1cm以上時(shí)才可見，早期發(fā)現(xiàn)概率不高。因此肝癌的早期診斷僅靠AFP易造成誤診和漏診。為了彌補(bǔ)單一指標(biāo)檢測(cè)的不足，提高肝癌早期診斷的準(zhǔn)確性，多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)已成必然趨勢(shì)。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得篩選新的腫瘤血清蛋白標(biāo)志物成為可能。借助該技術(shù)，研究者們不僅發(fā)現(xiàn)了許多與肝癌早期發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系的差異表達(dá)蛋白（潛在的腫瘤標(biāo)志物）。還開辟了改善癌癥相關(guān)血清標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)與鑒定的新途徑—高靈敏度、高特異性、微型化，

3、集成化，高通量化的抗體芯片技術(shù)。作為一種在基片表面固定多種高親和性和高特異性抗體并可用于平行檢測(cè)樣本中蛋白表達(dá)水平的通量化蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，它解決了傳統(tǒng)的蛋白檢測(cè)分析技術(shù)一次實(shí)驗(yàn)只能分析一種靶蛋白分子，在分析通量上難以滿足對(duì)眾多的潛在腫瘤血清蛋白標(biāo)志物篩選分析的需求問題，并且已經(jīng)向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等。因此，抗體芯片技術(shù)有可能發(fā)現(xiàn)與肝癌早期發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血清蛋白標(biāo)志物，這將極大地推進(jìn)肝癌相關(guān)血清蛋白標(biāo)志物的研究

4、進(jìn)展，為肝癌的早期診斷和治療奠定基礎(chǔ)。
　　研究技術(shù)路線:┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓┃用ELISA方法篩選有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的TM┃┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┫┃↓┃┃用于肝癌早期發(fā)現(xiàn)定量抗體芯片的構(gòu)建┃┣━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃┃→優(yōu)化抗體芯片制備及檢測(cè)的工作條件┃┃┃→考察構(gòu)建定量抗體芯片方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性┃┃┃→

5、ELISA萬法與定量抗體芯片方法的相關(guān)性分析┃┃┃→ELISA與定量抗體芯片的方法學(xué)比較┃┃┃┃┣━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃創(chuàng)建用于肝癌早期發(fā)現(xiàn)的判別模型┃┃↓┃┣━━━┳━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┫┃┃多重定量抗體芯片的臨床驗(yàn)證┃┃┗━━━┻━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┛
　　第一部分 HCC早期發(fā)現(xiàn)腫瘤血清蛋白標(biāo)志物的選擇
　　肝癌早期診斷

6、標(biāo)志物的研究一直是肝臟疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。人類肝癌發(fā)生的背景，絕大多數(shù)與肝炎病毒(HBV、HCV)的慢性持續(xù)性感染有關(guān)，有著乙肝病毒感染→慢性肝炎→肝硬化→肝癌的發(fā)生發(fā)展模式。
　　近年來，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，肝癌血清標(biāo)志物的研究取得了新的進(jìn)展，許多與早期診斷存在密切聯(lián)系的潛在血清蛋白標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，慢性炎癥的刺激導(dǎo)致腫瘤釋放許多直接促進(jìn)其自身生長的因子，從而

7、構(gòu)成了炎性微環(huán)境，主要由腫瘤細(xì)胞、宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、分泌因子等組成，各成分之間的交互作用形成一個(gè)龐大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。因此，慢性病毒感染機(jī)體后，效應(yīng)T細(xì)胞及Th細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子（IL-6、IL-10、TNF等），在體內(nèi)構(gòu)成免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，作用于病毒感染的靶細(xì)胞，這些因子與相應(yīng)受體結(jié)合，引起組織或器官的免疫病理損傷[1]，故檢測(cè)肝癌患者體內(nèi)血清細(xì)胞因子的含量能夠在一定程度上反映病情的發(fā)生發(fā)展及預(yù)

8、后。研究還發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞及其間質(zhì)細(xì)胞可分泌多種化學(xué)趨化因子及生長因子（IL-8、 HGF、TGF-β1、VEGF等）從而促進(jìn)腫瘤血管生成及腫瘤浸潤能力[2]，與HCC的發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)，已成為HCC預(yù)測(cè)的重要生物學(xué)標(biāo)志物[3]。但研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血清蛋白標(biāo)志物均為非特異的腫瘤相關(guān)抗原，其單獨(dú)檢測(cè)腫瘤的敏感性及特異性有限。因此在積極研究探索新的肝癌早診血清標(biāo)志物的同時(shí)，對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的潛在的肝癌早診標(biāo)志物進(jìn)行全面、系統(tǒng)的血清學(xué)篩選

9、和優(yōu)化組合，從中挖掘出更多的具有臨床診斷價(jià)值的血清標(biāo)志物以早期發(fā)現(xiàn)和輔助診斷肝癌一直是蛋白質(zhì)組學(xué)的努力方向。
　　為此我們運(yùn)用傳統(tǒng)的免疫分析方法—酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbentassay，ELISA)，對(duì)研究報(bào)道較多的、具有腫瘤早診潛能的血清標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，范圍包括肝癌的蛋白質(zhì)抗原、酶和同工酶、細(xì)胞因子等多方面。我們對(duì)50例肝癌患者和32例肝硬化患者血清，進(jìn)行了15種蛋白質(zhì)(HGF、IG

10、F、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF、HCCR、SCCA、GPC3、GP73、DCP、AFP-L3、AFU、HSP27)濃度的定量檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果中15種蛋白質(zhì)分別在HCC和LC患者血清中的濃度、上調(diào)及下調(diào)的趨勢(shì)、P值，并以炎癥性細(xì)胞因子與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)為依據(jù)，以構(gòu)建多重定量抗體芯片中抗體間高度特異性的相關(guān)選擇為目標(biāo)，篩選和最終確定了AFP聯(lián)合7種腫瘤血清蛋白標(biāo)志物（主要以細(xì)胞因子），包括AFP、HGF、IGF、

11、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1和VEGF作為構(gòu)建多重腫瘤血清蛋白標(biāo)志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)的組成。
　　第二部分多重腫瘤血清蛋白標(biāo)志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建
　　鑒于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物的臨床檢測(cè)技術(shù)—ELISA、免疫組織化學(xué)(IHC)、放射免疫分析(RIA)等，只能檢測(cè)單個(gè)或有限指標(biāo)的局限性，以微列陣技術(shù)對(duì)生物樣品作整體蛋白質(zhì)表達(dá)分析的蛋白質(zhì)芯片在后基因組時(shí)代越來越受到重視?？贵w芯片(antibody

12、 microarray)是蛋白質(zhì)芯片的一種，具有高通量、快速、平行分析生物樣品、高信噪比和所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)生物樣品中蛋白表達(dá)模式的新方法，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為平行性的定性和定量檢測(cè)生物樣品中蛋白質(zhì)分子的重要平臺(tái)，并能夠較全面和準(zhǔn)確地反映出在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，尤其在對(duì)腫瘤的相關(guān)蛋白的分析研究中，通過篩選及鑒定具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)行腫瘤的早期診斷及治療監(jiān)測(cè)。目前臨床常采用多腫瘤標(biāo)志物(tumor

13、markers，TM)聯(lián)合檢測(cè)，應(yīng)用多變量分析方法，以利于肝癌篩查及早期診斷的準(zhǔn)確性。為此，在第一部分工作的基礎(chǔ)上，我們購置了與肝癌早期診斷相關(guān)的8種腫瘤血清蛋白標(biāo)志物(AFP、HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF)的標(biāo)準(zhǔn)品、單克隆抗體及抗體芯片等材料，運(yùn)用雙抗體夾心法確定了抗體間的最佳濃度，排除了各抗原、抗體之間交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了抗體的有效固定及理想的檢測(cè)信號(hào)，獲得了每個(gè)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)范圍、最低檢測(cè)限、精密

14、度及芯片的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化研究，成功構(gòu)建了可用于臨床血清樣品篩查的多重抗體芯片定量檢測(cè)系統(tǒng)，并與傳統(tǒng)的ELISA法在檢測(cè)能力與相關(guān)性上進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)于相同樣品二種方法有很好的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，我們初步進(jìn)行了臨床驗(yàn)證。
　　第三部分多重腫瘤血清蛋白標(biāo)志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)的臨床驗(yàn)證
　　利用構(gòu)建的抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了218例血清樣本，其中肝硬化患者58例，平均年齡46.7歲（2

15、3-68歲），男性46人，女性12人;肝癌患者160例，平均年齡46.5歲（22-71歲），男性128人，女性32人，均經(jīng)臨床確診。通過定量檢測(cè)8種常見腫瘤血清蛋白標(biāo)志物（AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子）分別在HCC及LC患者血清中的濃度，并對(duì)臨床資料進(jìn)行回顧性研究，應(yīng)用SPSS軟件做Logistic回歸分析，利用訓(xùn)練集創(chuàng)建診斷模型，獲得AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子各單項(xiàng)指標(biāo)及其聯(lián)合的受試者工作曲線(receiver operating charac

16、teristic curve，ROC)、曲線下面積(area under the curve，AUC)以及Cut off值，并在測(cè)試集中驗(yàn)證了模型的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示8種腫瘤標(biāo)志物L(fēng)ogistic回歸模型的AUC為0.940（cut off值0.31），而AFP其AUC為0.665（cut off值20ng/ml），二者差異顯著，p＜0.001。AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子在訓(xùn)練集中診斷的敏感性為93.3％，特異性為83.3％，準(zhǔn)確性為90.

17、9％;在測(cè)試集中敏感性為89％，特異性為77.3％，準(zhǔn)確性為86％，明顯優(yōu)于血清AFP的診斷能力，后者診斷的敏感性為70％，特異性為59％，準(zhǔn)確性為64％。多重定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)具有較高敏感性和特異性，AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子診斷模型對(duì)肝癌早期診斷優(yōu)于傳統(tǒng)AFP，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。驗(yàn)證流程:
　　結(jié)論
　　1.利用50例肝癌患者和32例肝硬化患者的血清，應(yīng)用ELISA方法獲取了15種具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤血清蛋白標(biāo)

18、志物的定量數(shù)據(jù)，篩選和最終確定了AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子(HGF、IGF、IL-6、IL-8、I-10、TGF、VEGF)為多重腫瘤血清蛋白標(biāo)志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)的組成。
　　2.確立了雙抗體夾心法對(duì)8種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)范圍、最低檢測(cè)限、精密度、穩(wěn)定性、ELISA法相關(guān)性及二者在檢測(cè)能力上的的比較，成功構(gòu)建了可用于臨床血清樣品篩查的多重腫瘤血清蛋白標(biāo)志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)。
　　3.應(yīng)用多重定量抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)

19、合臨床樣本，運(yùn)用Logistic回歸分析創(chuàng)立了AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子的肝癌早期發(fā)現(xiàn)診斷模型，并驗(yàn)證了該模型潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值
　　1.可通量化檢測(cè)血清中多種腫瘤蛋白標(biāo)志物的抗體芯片的構(gòu)建，有助于肝癌血清標(biāo)志物的基礎(chǔ)研究能盡快應(yīng)用于HCC的臨床早期診斷中。
　　2.AFP聯(lián)合7種細(xì)胞因子作為肝癌早期發(fā)現(xiàn)的血清蛋白標(biāo)志物，可提高肝癌早期診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.運(yùn)用