臍血誘導(dǎo)分化樹突狀細(xì)胞WT-1基因的轉(zhuǎn)染及其功能的研究.pdf

1、目的： 1.構(gòu)建高效、高活性的真核表達WT-1基因重組腺病毒載體； 2.建立一套成熟完整的適合臍血CD34<'+>造血干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化為DC細(xì)胞的體系。 3.構(gòu)建具有特異呈遞WT-1多肽低抗原性樹突狀細(xì)胞，并對其功能進行鑒定。 方法： 實驗一：分別從人工培養(yǎng)的K-562和HL-60細(xì)胞中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，應(yīng)用特異引物從cDNA文庫中擴增WT

2、1基因，經(jīng)凝膠電泳初步確定擴增片斷的大小，凝膠切割回收。把穿梭質(zhì)粒pStluttle-CMV和擴增的WT1基因片段應(yīng)用Xbal和Notl雙酶切，再用T4連接酶連接，應(yīng)用CaCLm<,2>法把連接產(chǎn)物導(dǎo)入處于感受態(tài)的大腸桿菌E.coli DH1OB中，經(jīng)卡那霉素篩選出陽性菌落。擴增陽性菌落，提取質(zhì)粒，再酶切鑒定，經(jīng)測序進一步鑒定pShLlttle-CMV/WT-1攜帶目的基因所要的是WT-1基因序列。腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1對E.

3、coli BJ5183的轉(zhuǎn)化，經(jīng)氨芐青霉素篩選出陽性菌落，這些陽性菌落是含有pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒的BJ5183大腸桿菌，擴增陽性菌落。另外應(yīng)用Pme Ⅰ酶單酶切構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV/WT-1以線性化，用線性化的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV/WT-1電轉(zhuǎn)化含有pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒的BJ5183大腸桿菌。經(jīng)卡那霉素篩選出陽性克隆，擴增陽性菌落，提取質(zhì)粒。用Pac Ⅰ酶酶切重組的腺病毒質(zhì)粒，

4、形成線形的重組腺病毒質(zhì)粒。應(yīng)用脂質(zhì)體把線形的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成完整腺病毒，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中擴增WT-1基因和應(yīng)用蛋白印記技術(shù)Westernblot測定WT-1基因在轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中的表達，來進行重組腺病毒的鑒定。 實驗二：無菌條件下常規(guī)采集臍血，采用密度梯度離心法分離臍血中的單個核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)2小時去除懸浮細(xì)胞后，獲得單個核細(xì)胞。將獲得的單個核細(xì)胞分為7組，每組加入2ml的RPMI-16

5、40培養(yǎng)基，分別添加細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)樹突細(xì)胞的生成，1組：1000u/ml的rhIL-4和2000u/ml的rhGM-CSF：2組：2000u/ml的rhIL-4和2000u/ml的rhGM-CSF；3組：1000u/ml的rhIL-4和1000u/ml的rhGM-CSF：4組：1000u/ml的rhIL-4和2000u/ml的rhGM-CSF，培養(yǎng)5天后加入TNF-α 50u/ml：5組：2000u/ml的rhIL-4和2000u/m

6、l的rhGM-CSF，培養(yǎng)5天后加入TNF-α 50u/ml：6組：1000u/ml的rhIL-4和1000u/ml的rhGM-CSF，培養(yǎng)5天后加入TNF-α 50u/ml；7組為對照組，不加任何細(xì)胞因子。培養(yǎng)14天后，收集貼壁細(xì)胞，分別作細(xì)胞推片和用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面的CD83、CD86、CD14、HL-A-DR等免疫標(biāo)記。 實驗三：體外誘導(dǎo)臍血CD34<'+>造血干細(xì)胞分化為DC細(xì)胞經(jīng)攜帶人WT-1基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)

7、染后，用轉(zhuǎn)染的DC細(xì)胞與外周血的淋巴細(xì)胞共孵育制備細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，通過測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中γ-IFN的含量來推測經(jīng)WT-1基因改良的樹突細(xì)胞誘導(dǎo)生成Th1淋巴細(xì)胞量；通過適當(dāng)比例將DC細(xì)胞與異基因的淋巴細(xì)胞共孵育3天后，分離混合細(xì)胞中的懸浮細(xì)胞，應(yīng)用MTT比色法和乳酸脫氫酶法測定懸浮細(xì)胞中CTL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞K562和HL60的殺傷活性。 結(jié)論： 1.K562和HL60腫瘤細(xì)胞高表達WT-1基因，WT-1多肽可以作為