新結(jié)構(gòu)的新生血管抑制劑的篩選及其對子宮內(nèi)膜作用的研究.pdf

1、目的：篩選以2-甲氧雌二醇為基礎(chǔ)的新結(jié)構(gòu)的新生血管抑制劑和研究2-甲氧雌二醇對子宮內(nèi)膜VEGF表達的影響并初步探討其作用機制。 方法：1．剪開臍動脈以避免血細胞污染、膠原酶灌注消化，并給予充足的營養(yǎng)，體外分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)。2．建立兩種新生血管抑制劑篩藥模型：HUVEC增殖抑制試驗以及雞胚絨毛尿囊膜試驗，并篩選藥物。3．采用膠原酶消化，200目的尼龍篩過濾，傳代2次，體外分離、培養(yǎng)正常人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞；同

2、時采用醋酸甲地孕酮(MPA)及雙丁酰環(huán)磷酸腺苷(db-cAMP)誘導(dǎo)蛻膜化，形成蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞。4．子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞接種后，分別加入1、10、50μmol/L濃度的2-甲氧雌二醇，空白對照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)方法，分析2-甲氧雌二醇對VEGF分泌的影響，并用實時定量RF-PCR法從mRNA水平對結(jié)果進行驗證。5．向蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中分別加入1、10、50μmol/L 濃度的2-

3、甲氧雌二醇，空白對照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后用ELISA方法，分析2-甲氧雌二醇對VEGF分泌的影響，并用實時定量RT-PCR法從mRNA水平對結(jié)果進行驗證。6．免疫細胞化學(xué)方法分析2-甲氧雌二醇對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞雌激素受體(ER)表達的影響。 結(jié)果：1．體外分離、培養(yǎng)HUVEC，純度達99％。2．成功建立雞胚絨毛尿囊膜試驗?zāi)Ｐ?；HUVEC增殖抑制試驗確定了2-甲氧雌二醇IC<,50>=0.931

4、2 μmol/L，且結(jié)果與文獻報道(0.84 μmol/L)接近。目前尚未篩出活性與2-甲氧雌二醇類似或優(yōu)于2-甲氧雌二醇的目標化合物。3．成功培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜細胞；傳2代后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞純度較高，此時誘導(dǎo)蛻膜化，可見不僅細胞形態(tài)發(fā)生改變，且能合成和分泌催乳素(PRL)。4．低劑量2-甲氧雌二醇能降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞上清液中VEGF水平(P<0.05)；中劑量雖然能降低上清液中VEGF水平，但無統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量時子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞上清

5、液中VEGF水平較對照組升高，亦無統(tǒng)計學(xué)意義。實時定量RT-PCR驗證分析的結(jié)果和ELISA結(jié)果一致。5．低、中劑量的2-甲氧雌二醇可以降低蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞上清液中VEGF水平(P<0.05)；而高劑量則顯著降低上清液中VEGF水平(P<0.01)。實時定量RF-PCR驗證分析的結(jié)果和ELISA結(jié)果一致。6．免疫細胞化學(xué)分析結(jié)果顯示，三個濃度的2-甲氧雌二醇對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞ER表達均無影響。 結(jié)論

6、：1.2-甲氧雌二醇可以抑制雞胚絨毛尿囊膜試驗?zāi)Ｐ椭械难苌?；HUVEC增殖抑制試驗確定了2-甲氧雌二醇IC<,50>=0.9312μmol/L，且結(jié)果與文獻報道(0.84μmol/L)接近，結(jié)合子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞排除細胞毒性結(jié)果，再次確認了2-甲氧雌二醇的抑制新生血管形成活性，同時也證實兩種篩藥模型的建立。2.目前已成功合成了兩類保留2-甲氧雌二醇活性必需基團的與雌激素骨架相似的非甾體化合物，但在加上米非司酮抗孕激素受體基團這一步驟上

7、出現(xiàn)困難，故尚未獲得目標化合物。3.2-甲氧雌二醇低中劑量能稍降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞分泌VEGF水平，高劑量時則稍促進VEGF分泌，但影響程度均不大；提示2-甲氧雌二醇對靜止細胞功能影響較小。4.采用MPA和db-cAMP誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化，模擬人體正常的蛻膜化過程。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化后，不僅細胞形態(tài)發(fā)生改變，而且能合成和分泌PRL，均證明子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化過程的發(fā)生。5.2-甲氧雌二醇低中劑量即降低蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞

8、分泌VEGF水平；而高劑量則顯著抑制VEGF的分泌。眾所周知，血管生成是胚泡植入的關(guān)鍵步驟，而VEGF又在血管生成過程中發(fā)揮重要作用，因此上述結(jié)果提示該藥可通過抑制VEGF而影響胚泡植入及妊娠維持，從而發(fā)揮抗早孕作用。同時2-甲氧雌二醇不影響蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞ER表達，因此上述作用不是通過影響ER表達而發(fā)揮作用的，提示2-甲氧雌二醇作用后并不影響雌激素的分泌及其相關(guān)效應(yīng)，推測由此引發(fā)的不良反應(yīng)減少。傳統(tǒng)的抗早孕藥物均依靠影響雌孕激素