RANTES在大鼠附睪基細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、在過去的三十年,整個(gè)人類的生育能力在逐漸降低。不孕癥是現(xiàn)在世界上1/6的夫婦主要的健康問題。其中男性生殖功能紊亂占很大比例,目前大部分男性的病因仍不能被解釋。男性不育癥常見的病因包括精子運(yùn)動(dòng)能力低下和精卵結(jié)合力降低。精子在睪丸中完成形態(tài)分化,只有在通過附睪的過程中,精子經(jīng)歷一系列復(fù)雜的變化后,才能獲能而達(dá)到功能上的成熟,并在附睪內(nèi)儲(chǔ)存。附睪是由大量的曲細(xì)精管構(gòu)成,在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上有明顯的區(qū)域劃分,包括起始部、頭部、體部、尾部。附睪上皮

2、有四種不同形態(tài)的細(xì)胞分布,而每一種細(xì)胞均參與形成并調(diào)節(jié)附睪管腔液體的酸性環(huán)境,以此維持精子的濃縮、成熟、儲(chǔ)存、趨化運(yùn)動(dòng)。精子在附睪中成熟和儲(chǔ)存過程需要一個(gè)低碳酸氫鹽和低pH的環(huán)境來維持精子靜息狀態(tài)。附睪上皮細(xì)胞作為一個(gè)整體,能夠協(xié)同作用,建立和維持附睪酸性微環(huán)境。亮細(xì)胞在頂膜上表達(dá)高水平的V-ATP酶,通過ATP供能把質(zhì)子泵入附睪管腔中,亮細(xì)胞胞漿內(nèi)的可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)是一種HCO3-依賴性的化學(xué)感受器,可以直接被HCO3-激

3、活,從而使cAMP濃度升高,導(dǎo)致V-ATP酶在頂膜上的聚集。主細(xì)胞能夠分泌HCO3-至附睪管腔。而來自于精子和主細(xì)胞的ATP被釋放入管腔,且有狹長突起的基細(xì)胞能夠特異性地表達(dá)ANGII的II型受體(AGTR2),這些受體受到ANGII的刺激后,能夠使V-ATP酶在附睪亮細(xì)胞的頂膜面微絨毛聚集。ANGII可以作用于附睪上皮基細(xì)胞腔膜面上的受體,激活了NO的產(chǎn)生,NO經(jīng)過旁分泌進(jìn)入亮細(xì)胞內(nèi),激活sGC,sGC繼而引發(fā)了cGMP介導(dǎo)的V-AT

4、P酶在亮細(xì)胞微絨毛的聚集。由此,附睪上皮主細(xì)胞和亮細(xì)胞、基細(xì)胞和亮細(xì)胞之間形成復(fù)雜的協(xié)同關(guān)系,共同維持管腔液的酸性環(huán)境。而關(guān)注和破譯這些胞內(nèi)的對(duì)話能夠幫助我們定義男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育機(jī)制。
　　受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES),最初被認(rèn)為是一種典型的趨化性細(xì)胞因子。RANTES被報(bào)道具有多重

5、的生理學(xué)和病理學(xué)效應(yīng),例如在免疫學(xué)效應(yīng)上,RANTES不但具有抑制HIV病毒復(fù)制的能力,而且在特定的環(huán)境下能增強(qiáng)復(fù)制,且對(duì)腫瘤有一定的誘導(dǎo)和促生長作用。RANTES通過4種趨化因子受體傳導(dǎo)信號(hào),包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5,均屬于7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。其中CCR1和CCR5屬于高親和力受體。
　　我們目前的研究認(rèn)為RANTES特異性高表達(dá)在附睪組織,在精子成熟過程中具有非常重要的作用。之前我們已明確基細(xì)胞作

6、為附睪管腔環(huán)境的感受器能與亮細(xì)胞協(xié)同作用。具體來說,基細(xì)胞釋放NO調(diào)節(jié)鄰近亮細(xì)胞,調(diào)控其V-ATPase依賴的質(zhì)子分泌,同時(shí)基細(xì)胞能夠特異性地表達(dá)ANGII的II型受體(AGTR2),這些受體受到附睪管腔內(nèi)ANGII的刺激后,也能夠促使亮細(xì)胞泌酸。有文獻(xiàn)報(bào)道RANTES可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO,而基細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與巨噬細(xì)胞極其相似,被認(rèn)為是附睪管腔內(nèi)固定的巨噬細(xì)胞。由此推測RANTES可能在ANGII的刺激下通過自分泌方式,激活基細(xì)胞釋

7、放NO,再經(jīng)NO信號(hào)通路,在基細(xì)胞與亮細(xì)胞的串話調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,進(jìn)而協(xié)助維持附睪管腔液體的酸性環(huán)境。
　　為了研究RANTES在附睪酸性微環(huán)境中的作用,本實(shí)驗(yàn)首先檢測了RANTES在正常大鼠附睪內(nèi)的表達(dá),進(jìn)而利用輸精管切除術(shù)構(gòu)建附睪酸性微環(huán)境破壞的模型,對(duì)比觀察手術(shù)組和假手術(shù)組RANTES的變化,證明RANTES參與調(diào)節(jié)附睪管腔酸性微環(huán)境的作用,為深入探討該分子在精子成熟過程中的重要作用與具體機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)分

8、為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分:RANTES在大鼠附睪的表達(dá)與定位
　　通過PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法等技術(shù)檢測大鼠附睪RANTES及其受體CCR1、CCR5的表達(dá),主要結(jié)果如下:
　　1、PCR結(jié)果顯示RANTESmRNA在大鼠附睪有表達(dá)。Western blot檢測到RANTES蛋白在大鼠附睪頭部、尾部有較高表達(dá),在體部的表達(dá)量相對(duì)較低。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果提示,RANTES在附睪管上皮的上

9、皮細(xì)胞有高表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)利用基細(xì)胞特異性細(xì)胞標(biāo)記物COX1,進(jìn)一步證實(shí)了RANTES定位在附睪上皮的基細(xì)胞。
　　2、PCR結(jié)果顯示RANTES受體CCR1和CCR5mRNA在附睪均有表達(dá),Western blot檢測到CCR1、CCR5蛋白在大鼠附睪頭部、體部和尾部均有表達(dá)。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明受體CCR1、CCR5在附睪上皮表達(dá)于基細(xì)胞。免疫熒光雙標(biāo)染色分別檢測RANTES與CCR1、CCR5的細(xì)胞共定位情況,顯示RA

10、NTES與CCR1、CCR5在附睪管的基細(xì)胞共存。
　　以上結(jié)果表明:RANTES與CCR1、CCR5共定位在附睪管的基細(xì)胞,推測RANTES可能通過自分泌方式在大鼠附睪基細(xì)胞功能活動(dòng)方面起重要作用。
　　為了證實(shí)這個(gè)推測,我們進(jìn)行第二部分的模型研究。
　　第二部分:附睪酸性環(huán)境被破壞后,RANTES及其受體的表達(dá)變化
　　建立大鼠輸精管切除術(shù)后附睪管腔酸性微環(huán)境被破壞的動(dòng)物模型,采用放射免疫分析技術(shù)檢測附睪組織

11、勻漿液上清內(nèi)ANGII水平的變化;Realtime PCR檢測ANGII受體AGTR2mRNA水平的變化,Western blot檢測AGTR2蛋白水平的變化后;進(jìn)一步通過Realtime PCR、Western blot觀察RANTES及其受體在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)變化,并用Realtime PCR、Western blot檢測iNOsmRNA水平和蛋白水平的變化。
　　主要結(jié)果如下:
　　1、檢測大鼠附睪管腔pH值

12、,pH值增高,說明模型建立成功,實(shí)驗(yàn)可用。輸精管切除術(shù)后,附睪管腔酸性微環(huán)境被破壞,ANGII水平顯著下調(diào),AGTR2mRNA和蛋白水平明顯降低;
　　2、實(shí)時(shí)定量PCR證明手術(shù)組與假手術(shù)組相比,RANTES在大鼠附睪頭部、體部和尾部的表達(dá)水平明顯降低。Western blot顯示,RANTES及其受體CCR1、CCR5在大鼠附睪頭部、體部和尾部的表達(dá)水平明顯下降。
　　3、iNOs在大鼠附睪頭部、體部和尾部的mRNA和蛋白

13、水平顯著降低。
　　這些結(jié)果顯示輸精管切除術(shù)后影響了附睪管腔酸性微環(huán)境的改變,RANTES及其受體的表達(dá)量降低,表明RANTES對(duì)維持附睪管腔酸性微環(huán)境具有積極的作用。該結(jié)果與我們第二部分的推測一致。總之,我們的研究結(jié)果表明RANTES可能在ANGII的刺激下通過自分泌方式,激活基細(xì)胞釋放NO,再經(jīng)NO信號(hào)通路,在基細(xì)胞與亮細(xì)胞的串話調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,從而協(xié)助維持附睪管腔液的酸性環(huán)境。維持精子處于靜息狀態(tài),其具體機(jī)制還有待我們?cè)诩?xì)胞