不同膠體液對失血性休克大鼠血流變和炎癥反應的影響及CNP抗炎機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　失血性休克是創(chuàng)傷導致死亡的主要原因。液體復蘇是失血性休克救治的重要措施，用以恢復并維持有效循環(huán)血量，減輕機體損傷。然而，在失血性休克治療中，通過復蘇恢復正常血容量后，一部分患者仍然面臨全身炎癥反應甚至多器官功能障礙征發(fā)生的危險。研究表明，失血性休克復蘇后氧化應激、炎癥反應及微循環(huán)障礙是導致多器官功能障礙的主要原因。首先，失血性休克及其復蘇過程中缺血再灌損傷會引發(fā)氧化應激和炎癥反應，破壞腸道粘膜屏障功能，導致腸

2、道內(nèi)毒素入血，引發(fā)全身炎癥反應綜合征及多器官功能障礙綜合征。其次，休克復蘇會影響血液流變學特性，進一步影響組織微循環(huán)功能，與多器官功能障礙的發(fā)生相關(guān)。因此液體復蘇作為失血性休克早期治療的重要手段，在恢復和維持正常循環(huán)血容量的同時，還應該減少機體氧化應激和炎癥反應的產(chǎn)生，并改善血流變特性和微循環(huán)功能。研究發(fā)現(xiàn)，復蘇液的選擇與失血性休克復蘇后血流變特性、氧化應激及炎癥損傷相關(guān)，直接影響失血性休克的救治效果。我們在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在失血性休克

3、救治中，復蘇液的選擇仍然缺乏統(tǒng)一的標準。目前的研究中，臨床常用的人工膠體復蘇液HES130/0.4、HES200/0.5以及GEL對失血性休克復蘇后氧化應激、炎癥反應及血流變的差異性影響尚缺乏系統(tǒng)比較研究。所以，在第一、二部分實驗中，利用大鼠失血性休克模型，研究目前常用的人工膠體復蘇液對失血性休克復蘇后氧化應激、炎癥反應及血流變特性的影響，為失血性休克的救治中復蘇液的選擇提供思路和實驗依據(jù)。
　　隨著對失血性休克病理生理過程認識的

4、不斷深入，目前已從整體、器官水平深入到細胞、分子水平。對于失血性休克的治療，新型安全有效、作用機制明確的抗休克藥物的發(fā)現(xiàn)為失血性休克的治療展示了廣闊的前景。C型利尿鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)是利尿鈉肽家族重要成員，其生物學作用廣泛，具有利鈉排尿、舒張血管等功能。在失血性休克血管再充盈期，CNP能夠發(fā)揮減輕組織水腫、改善微循環(huán)、保護腎功能等作用，是一種潛在的新型抗休克藥物。以往研究表明，在血管球囊

5、損傷動物模型中，CNP能夠降低血管粘附分子的表達，顯示其可能具有抗炎作用。目前，CNP的抗炎機制尚不明確。第三部分研究以休克后炎癥反應發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)-內(nèi)皮細胞活化作為切入點，建立脂多糖誘導的內(nèi)皮細胞活化模型，研究CNP是否通過減弱內(nèi)皮細胞活化發(fā)揮抗炎作用，并從致炎信號通路入手探討CNP抗炎的分子機制，為下一步體內(nèi)實驗的深入研究提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　第一部分:合成膠體復蘇液在體外和失血性休克模型中對血流變特性的影響<

6、br>　　方法:在體外實驗中，雄性SD大鼠經(jīng)腹腔戊巴比妥鈉麻醉后，分離股動脈并插管放血，肝素抗凝，離心調(diào)整紅細胞壓積到40％后分成四份，一份作為空白對照組，另外三份分別與6％的羥乙基淀粉130/0.4(hydroxyethyl starch130/0.4，HES130)、6％的羥乙基淀粉200/0.5(hydroxyethyl starch200/0.5，HES200)以及琥珀酰明膠(succinylated gelatin，GEL)以

7、5∶1和3∶1（由臨床報道的血藥濃度確定）的比例混合。37℃孵育15分鐘后，離心調(diào)節(jié)紅細胞壓積至40％，測量紅細胞變形指數(shù)、聚集指數(shù)及聚集幅度，上層血漿用于檢測血漿黏度。
　　在體內(nèi)實驗中，將雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、HES130組、HES200組及GEL組。本研究采用控量失血性休克模型，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，分離股動脈和股靜脈并插管，除Sham組外，各組大鼠穩(wěn)定10分鐘后開始放血，首先，在30分鐘內(nèi)，經(jīng)股動脈

8、以0.26 ml/min速率放血，放血量約為30％的總血量，接著，從第30分鐘開始以0.13 ml/min的速率放血，放血量約為20-25％的總血量，并維持休克狀態(tài)到65分鐘。當大鼠動脈酸堿剩余值在-9mmol/L-12 mmol/L之間時，HES130、HES200以及GEL組分別輸注一倍失血量的膠體液，復蘇2h后，取動脈血測量紅細胞變形指數(shù)(elongation index，EI)、血漿黏度、聚集指數(shù)(aggregation ind

9、ex，AI)及聚集幅度(aggregation amplitude，AMP)。
　　結(jié)果:在體外實驗中，HES130、HES200以及GEL組血漿黏度顯著高于對照組。GEL組血漿黏度明顯高于HES200組，另外，HES130和HES200組血漿黏度無顯著差異。體內(nèi)實驗中，相對于假手術(shù)組，輸注GEL顯著提高血漿黏度，而輸注HES130和HES200都明顯降低血漿黏度。HES130和HES200組血漿黏度無顯著差異。
　　體外實

10、驗中，全血分別與三種復蘇液以3∶1混合后，各組100 s-1剪切率下EI顯著低于空白對照組。而在其他剪切率下，各組EI無顯著性差異。當全血分別與三種復蘇液以5∶1混合后，各組EI無顯著性差異。體內(nèi)實驗也顯示各組EI無顯著差異。
　　體外實驗中，混合比例為3∶1條件下，相對于空白對照組，GEL能顯著增加AI和AMP。HES130和HES200組AI顯著低于GEL組。HES200組AMP顯著低于GEL組。對于AI和AMP，HES130

11、、HES200和空白對照組之間無顯著差異。混合比例為5∶1條件下，相對于空白對照組，GEL能顯著增加AI和AMP。HES130和HES200組AI和AMP顯著低于GEL組。對于AI和AMP，HES130、HES200和空白對照組之間無顯著差異。另外，各組在兩種不同混合比例下的AI之間無顯著性差異?；旌媳壤?∶1條件下，HES130和HES200組AMP顯著高于混合比例5∶1條件下AMP。體內(nèi)實驗中，各組AI無顯著性差異。相對于假手術(shù)組，

12、GEL能夠顯著提高AMP。HES130和HES200組AMP顯著低于GEL組。對于AMP，HES130、HES200和假手術(shù)組之間無顯著差異。
　　結(jié)論:HES200/0.5和HES130/0.4對紅細胞聚集特性沒有明顯影響;而GEL能夠促進紅細胞聚集并顯著提高血漿黏度。
　　第二部分:合成膠體復蘇液對失血性休克后氧化應激和炎癥反應的影響比較
　　方法:將雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、HES130組、HE

13、S200組、GEL組。采用控量失血性休克模型，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，分離股動脈和股靜脈并插管，除Sham組外，各組大鼠穩(wěn)定10分鐘后開始放血，首先，在30分鐘內(nèi)，經(jīng)股動脈以0.26 ml/min速率放血，放血量約為大鼠30％的總血量，接著，從第30分鐘開始以0.13 ml/min的速率放血，放血量約為總血量20-25％，并維持休克狀態(tài)到65分鐘。當大鼠動脈酸堿剩余值在-9 mmol/L-12 mmol/L之間時，分別以一倍失血量的膠體

14、液進行輸注，復蘇2h后處死。實驗過程中，檢測放血前、休克后及復蘇后2h的動脈血氣。取動物組織檢測肝、腦、肺和小腸中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平。并檢測小腸IL-6和TNF-α水平。
　　結(jié)果:實驗結(jié)果表明，各組大鼠的基礎(chǔ)pH，pCO2，pO2以及酸堿剩余值(base excess，BE)無統(tǒng)計學差異。失血后，各組大鼠的pH，pCO2，pO2以及BE

15、值同樣無統(tǒng)計學差異。相較于GEL組，HES130組大鼠肝、肺、小腸和腦組織中MDA水平都顯著降低。相較于HES200，HES130顯著抑制肝、小腸和腦中MDA水平，但是兩組肺組織中MDA水平無統(tǒng)計學差異。另外，在所有組織中，GEL和HES200組之間MDA水平?jīng)]有顯著性差異。HES130組大鼠肝、肺、小腸和腦組織中MPO活性顯著低于HES200組。在四種組織中，HES130組MPO活性都顯著低于GEL組。而對于GEL組和HES200組，

16、各個組織中MPO活性無顯著性差異。相對于HES200，HES130輸注顯著降低小腸TNF-α水平。HES130組小腸TNF-α水平也顯著低于GEL組。對于HES200和GEL組，小腸TNF-α水平無統(tǒng)計差異。
　　結(jié)論:在大鼠失血性休克模型中，相較于HES200/0.5和GEL，HES130/0.4輸注降低失血性休克復蘇后各組織中氧化應激和炎癥反應。在33 ml/kg輸注劑量下，HES200/0.5或GEL組中氧化應激和炎癥反應水

17、平無顯著差異。
　　第三部分:C型利尿鈉肽抑制內(nèi)毒素誘導的內(nèi)皮細胞活化及機制研究
　　方法:采用MTT比色法檢測CNP對LPS刺激下細胞活力的影響;應用Westernblot及實時熒光定量PCR檢測不同濃度CNP對LPS刺激下臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)粘附分子表達;用Westernblot和ELISA方法檢測NF-κB p65磷酸化水平和NF-κB活化;利用Western blot檢測信號分子磷酸化水平;進一步應用熒光探

18、針檢測CNP對LPS刺激下HUVECs內(nèi)活性氧水平的影響。
　　結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)，1μg/ml LPS處理24 h能夠顯著降低HUVECs活性，0.01、0.1及1μM CNP處理沒有改變LPS刺激下的內(nèi)皮細胞活性。1μM CNP預處理能夠顯著抑制LPS誘導的內(nèi)皮細胞粘附分子-1(VCAM-1)、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、P-selectin和E-selectin的表達。LPS處理能夠顯著增強NF-κB p65的磷酸化水平

19、和DNA結(jié)合活性，而CNP能夠顯著抑制NF-κB p65的的磷酸化水平和DNA結(jié)合活性。LPS處理能夠在短時間內(nèi)引起內(nèi)皮細胞中ERK1/2、p38MAPK及JNK的活化。CNP分別在15和30分鐘時都顯著抑制ERK1/2和p38MAPK的磷酸化。而CNP在檢測的各個時間點都沒有影響JNK的活化水平。單獨抑制p38 MAPK或聯(lián)合抑制p38 MAPK和ERK1/2磷酸化都能夠顯著減弱LPS引起的ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表

20、達水平升高。而單獨抑制ERK1/2不能降低LPS誘導的ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表達水平。LPS處理能夠迅速引起細胞內(nèi)Akt磷酸化，并在15分鐘時達到高峰。與LPS組相比，CNP處理在15分鐘時增強Akt的磷酸化，在30分鐘時，CNP處理能夠維持Akt的磷酸化。而抑制PI3K/Akt信號通路活化能夠逆轉(zhuǎn)CNP的抑炎作用。另外，CNP能夠顯著增強HO-1的mRNA和蛋白表達水平。LPS處理1和3h能顯著增加ROS水平。而C

21、NP處理能夠顯著抑制LPS引起的ROS水平升高。
　　結(jié)論:CNP可以通過抑制p38和NF-κB通路，清除ROS及激活PI3K/Akt/HO-1通路減弱LPS誘導的內(nèi)皮細胞活化。
　　在失血性休克救治中，選擇合適的復蘇液對患者的救治至關(guān)重要。本研究結(jié)果提示，琥珀酰明膠能夠提高血漿黏度，改善血流變特性，可以應用于失血性休克早期血漿黏度嚴重下降的患者救治。HES130/0.4抑制失血性休克復蘇后組織氧化應激和炎癥反應水平，可以應