黃河鯉TLR家族成員對LPS的響應(yīng)模式和TLR4a-TLR4b基因克隆及表達分析.pdf

1、黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus）是河南重要的經(jīng)濟魚類之一。近年來，隨著黃河鯉高密度集約化養(yǎng)殖模式的不斷發(fā)展，其病害問題日益嚴(yán)重，給漁業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。因此，黃河鯉免疫和疾病防控對于黃河鯉養(yǎng)殖具有重要意義。弄清黃河鯉對病原的識別和響應(yīng)是有效防控疾病的重要內(nèi)容之一。Toll樣受體（Toll-like receptors, TLRs）作為一種重要的模式識別受體，可以特異性識別保守型的病原體相關(guān)分子模式，在

2、魚類的病原識別和啟動機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著及其重要的作用。脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，也稱為內(nèi)毒素，是養(yǎng)殖魚類爆發(fā)細(xì)菌性疾病的主要毒力因子之一。但在黃河鯉中，模式識別受體對LPS的免疫應(yīng)答缺乏系統(tǒng)研究。因此，弄清黃河鯉TLRs對LPS的免疫響應(yīng)模式及關(guān)鍵基因TLR4a/TLR4b的分子特征及表達變化，對黃河鯉的疾病防控具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　本文根據(jù)GenBan

3、k數(shù)據(jù)庫中鯉TLRs部分序列設(shè)計引物，采用RT-qPCR技術(shù)檢測鯉18種TLRs表達量，注射不同濃度（2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL）LPS后，檢測黃河鯉肝中18種TLRs在不同時間（3 h、6 h、12 h、1 d、2 d和3 d）的表達變化。結(jié)果顯示，TLR1、TLR4a、TLR4b、TLR5M、TLR20和TLR22的表達量明顯上調(diào)；TLR3、TLR18、TLR19和TLR25表達量下調(diào)；TLR7家族成員（TLR7

4、、TLR8和TLR9）、TLR2和TLR21表達量在大多數(shù)時間點無明顯變化。本研究是對黃河鯉 LPS刺激后所有己知TLRs家族成員表達模式的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)TLRs家族不同成員對LPS刺激表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。
　　本研究發(fā)現(xiàn)TLR4a和TLR4b對LPS應(yīng)激顯示明顯響應(yīng)，為此，對TLR4a和TLR4b的分子結(jié)構(gòu)特征和對LPS響應(yīng)的表達變化進行研究。采用RT-PCR和RACE方法，獲得黃河鯉TLR4a和TLR4b基因全長cDNA序列

5、，并對其進行結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源性分析，結(jié)果顯示：①黃河鯉TLR4a cDNA全長2836 bp，包含開放閱讀框（ORF）2325 bp，編碼794個氨基酸，5’非編碼區(qū)123 bp和3’非編碼區(qū)388 bp。在線預(yù)測TLR4a蛋白相對分子量為121.5 kD，理論等電點為5.73；包含6個LRR結(jié)構(gòu)域，1個LRR-CT基序，1個跨膜區(qū)和1個TIR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。②TLR4b cDNA全長序列為2897 bp，包含2466 bp的開放閱讀框，編碼

6、821個氨基酸，198 bp的5’非翻譯區(qū)和233 bp的3’非翻譯區(qū)。在線預(yù)測 TLR4b蛋白相對分子量為123.1 kD，理論等電點為5.81；包含8個LRR結(jié)構(gòu)域，1個LRR-CT基序，1個跨膜區(qū)和1個TIR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。③對不同魚類中氨基酸全長序列進行同源性分析，結(jié)果表明TLR4a和TLR4b在魚類中高度保守，推測其在魚類中扮演重要的生物學(xué)功能。系統(tǒng)進化分析表明，黃河鯉TLR4a和TLR4b與斑馬魚（Danio rerio） TL

7、R4a和TLR4b親緣關(guān)系最近。
　　采用半定量PCR方法檢測黃河鯉不同組織器官中TLR4a和TLR4b表達量。黃河鯉TLR4a和TLR4b在12種組織器官（肝、脾、腎、頭腎、腦、鰓、鰭、肌肉、腸道、心臟、血液和皮膚）中均可檢測到表達。TLR4a和TLR4b均是在脾和頭腎中表達量最高，血液和肌肉中表達量最低。RT-qPCR檢測3種濃度（2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mLl） LPS注射后不同時間點（3 h、6 h、12

8、 h、1 d、2 d和3 d）黃河鯉TLR4a和TLR4b在鰓、肝、脾和頭腎中的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS注射后，肝、脾和頭腎中 TLR4a和 TLR4b表達量明顯上調(diào)，但是，在鰓中TLR4a和TLR4b表達量無明顯變化。在脾和頭腎中，TLR4a和TLR4b均在高濃度組（8 mg/mL）注射6 h后達到了最高值。然而，在肝中，TLR4a和TLR4b在低濃度組（2 mg/mL）上調(diào)最顯著，在6 h分別達到了對照組的28.64倍和25.39倍