過(guò)氧化體增殖物激活型受體-γ通路在大鼠肥厚心肌缺血-再灌注損傷中的保護(hù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的： 心肌缺血再灌注損傷是心臟直視手術(shù)中影響心臟功能恢復(fù)的重要因素。近20年來(lái)，心肌缺血再灌注損傷機(jī)制和心肌保護(hù)措施的研究取得的進(jìn)展，促進(jìn)了心臟外科的發(fā)展。目前臨床上，一些合并有嚴(yán)重心室肥厚的心臟疾病，即使能夠進(jìn)行有效矯治手術(shù)，術(shù)后仍出現(xiàn)較重程度的心功能受損。心臟手術(shù)術(shù)后心功能不全，手術(shù)死亡率較高，其中一主要原因應(yīng)歸咎于不恰當(dāng)?shù)男募”Ｗo(hù)。目前眾多的研究關(guān)注肥厚心肌的缺血再灌注損傷，但仍未出現(xiàn)公認(rèn)的解決方法。心肌肥厚的

2、過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的心肌重構(gòu)的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中心肌細(xì)胞代謝特點(diǎn)發(fā)生變化，異常的炎性反應(yīng)發(fā)生，肥厚心肌對(duì)缺血再灌注損傷的敏感性明顯增加，對(duì)肥厚心肌需采取特殊的心肌保護(hù)措施來(lái)減輕缺血再灌注損傷。 近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化體增殖物激活型受體-γ(PPAR-γ)及其配體噻唑烷二酮(TIDs)類(lèi)藥物，在心肌細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注(I-R)損傷、細(xì)胞分化等諸多方面發(fā)揮著作用。本課題通過(guò)對(duì)PPAR-γ及其配體噻唑烷二酮(TID

3、s)類(lèi)藥物-羅格列酮鈉在大鼠肥厚心肌I-R損傷中的保護(hù)作用進(jìn)行研究，探討PPAR-γ在肥厚心肌I-R損傷中保護(hù)作用的機(jī)制。 研究方法：本研究分為三部分： 第一部分，24只純種雄性SD.大鼠，隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組(C組)；假手術(shù)組(S組)，腹主動(dòng)脈不結(jié)扎；心肌肥厚組(H組)，采用腹主動(dòng)脈縮窄4周的方法建立壓力負(fù)荷型大鼠左心室肥厚模型；心肌肥厚羅格列酮鈉組(H+組)在腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后3周，運(yùn)用羅格列酮鈉對(duì)心肌肥厚的大鼠處

4、理1周。通過(guò)觀察術(shù)后大鼠血流動(dòng)力學(xué)的變化，心肌肥厚指數(shù)，心肌形態(tài)學(xué)變化，運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)肥厚心肌中表達(dá)的蛋白BNPmRNA的表達(dá)量和PPAR-γmRNA的表達(dá)，運(yùn)用EMSA方法觀察核因子-кB(NF-кB)的激活情況來(lái)對(duì)壓力負(fù)荷型大鼠心肌肥厚模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，并觀察羅格列酮鈉對(duì)大鼠肥厚心肌的影響。 第二部分，分題一：用12只純種雄性SD.大鼠，隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(C組)和心肌肥厚組(H組)建立離體心臟灌注模型(包括Lan

5、gendorff模型和工作心臟模型)。觀察血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化和形態(tài)學(xué)的變化，來(lái)評(píng)價(jià)大鼠肥厚心肌I-R損傷的程度。 分題二：50只純種雄性SD.大鼠，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組(C組)；假手術(shù)生理鹽水處理組(S-組)術(shù)后3周，用生理鹽水對(duì)大鼠處理1周；假手術(shù)羅格列酮鈉處理組(S+組)術(shù)后3周，用羅格列酮鈉對(duì)大鼠處理1周；心肌肥厚生理鹽水處理組(H-組)在腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后3周，用生理鹽水對(duì)心肌肥厚的大鼠處理1周；心肌肥厚羅格列酮鈉處

6、理組(H+組)，在腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后3周，用羅格列酮鈉對(duì)心肌肥厚的大鼠處理1周。飼養(yǎng)期滿后，C組大鼠建立離體心臟工作模型，穩(wěn)定后記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，按要求留取標(biāo)本，心臟不作停跳復(fù)跳處理；其余各組(S-、S+、H-、H+組)在建立的離體心臟工作模型穩(wěn)定后，進(jìn)行心臟停跳與復(fù)跳處理，在心臟復(fù)跳后30分鐘記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并留取標(biāo)本。通過(guò)使用PPAR-γ的人工合成配體噻唑烷二酮(TIDs)類(lèi)藥物，羅格列酮鈉預(yù)處理心肌肥厚的大鼠1周，觀察心肌肥厚大

7、鼠心臟工作模型在羅格列酮鈉組和對(duì)照組中的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌酶、心肌中ATP、MDA的變化，評(píng)價(jià)羅格列酮鈉預(yù)處理對(duì)大鼠肥厚心肌I-R損傷的保護(hù)作用。 第三部分，50只純種雄性SD.大鼠，隨機(jī)分為5組，分組同上。以EMSA觀察羅格列酮鈉預(yù)處理對(duì)I-R前后心肌細(xì)胞NF-кB活性的影響，Westernblot觀察對(duì)I-кBα蛋白表達(dá)水平的變化，RT-PCR觀察心肌PPAR-γ、TNF-α、MCAD、PDHmRNA表達(dá)的變化，測(cè)量心肌組

8、織中游離脂肪酸含量，觀察羅格列酮鈉對(duì)大鼠肥厚心肌I-R過(guò)程中能量代謝及炎癥反應(yīng)的影響。探討PPAR-γ、TNF-α、MCAD、PDH表達(dá)變化與NF-кB活性、I-кBα蛋白表達(dá)水平變化的關(guān)系，研究PPAR-γ在大鼠肥厚心肌I-R損傷保護(hù)作用的機(jī)制。 研究結(jié)果： 第一部分： 1.大鼠腹主動(dòng)脈縮窄4周后，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)、心肌肥厚指數(shù)、心肌形態(tài)學(xué)變化以及心肌中蛋白BNPmRNA的表達(dá)證明采用腹主動(dòng)脈縮窄法成功建立了壓力

9、負(fù)荷型大鼠肥厚心肌模型。 2.觀察到在大鼠肥厚心肌中PPAR-γmRNA的表達(dá)下調(diào)和NF-кB激活，PPAR-γ配體羅格列酮鈉對(duì)PPAR-γmRNA的表達(dá)下調(diào)和NF-кB激活有抑制作用。第二部分： 1.用正常大鼠和腹主動(dòng)脈縮窄4周的心肌肥厚大鼠成功建立離體心臟灌注模型(包括Langendorff模型和工作心臟模型)。觀察血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化和形態(tài)學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)I-R對(duì)大鼠心肌造成明顯損傷，而且心肌肥厚大鼠I-R損傷的程度

10、較正常大鼠嚴(yán)重。 2.羅格列酮鈉預(yù)處理心肌肥厚大鼠，明顯改善了I-R后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，使心排出量增加，心肌酶譜改善，心肌細(xì)胞ATP、MDA明顯好于對(duì)照組(P＜0.01)；羅格列酮鈉預(yù)處理正常大鼠后對(duì)正常大鼠心肌I-R損傷的保護(hù)作用不明顯。 第三部分： 1.I-R使心肌細(xì)胞的NF-кB顯著活化，IкB蛋白表達(dá)下降，TNF-αmRNA表達(dá)明顯增加，反映粒細(xì)胞浸潤(rùn)的MPO含量升高，心肌的炎癥反應(yīng)加重，在肥厚心肌中更加明

11、顯(P＜0.01)。在I-R前用PPAR-γ配體羅格列酮鈉預(yù)處理，使肥厚心肌I-R后炎癥反應(yīng)減輕，相比生理鹽水組NF-кB活化降低(P＜0.01)，TNF-αmRNA表達(dá)下降(P＜0.01)，MPO含量減少(P＜0.01)，IкB蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)；羅格列酮鈉對(duì)正常心肌預(yù)處理，沒(méi)有明顯減輕I-R后的炎癥反應(yīng)。 2.I-R使心肌細(xì)胞的脂肪酸氧化關(guān)鍵酶MCADmRNA表達(dá)降低(P＜0.01)，使葡萄糖氧化關(guān)鍵酶PDHmRN

12、A表達(dá)的上調(diào)(P＜0.01)，心肌中能量代謝底物游離脂肪酸含量升高(P＜0.01)，在肥厚心肌中變化更顯著。羅格列酮鈉預(yù)處理，使肥厚心肌I-R后PDHmRNA的表達(dá)明顯較生理鹽水組高(P＜0.01)，但對(duì)MCADmRNA表達(dá)和心肌中游離脂肪酸含量影響不顯著。 結(jié)論： 1.采用SD大鼠，運(yùn)用腹主動(dòng)脈縮窄4周的方法成功建立了壓力負(fù)荷型大鼠左心室肥厚模型；PPAR-γ配體羅格列酮鈉處理1周后能減輕肥厚心肌中NF-кB活化和上調(diào)

13、PPAR-γmRNA表達(dá)的下降；羅格列酮鈉對(duì)心肌肥厚的程度影響不顯著。 2.建立Langendroff離體心臟灌注模型及離體工作心臟灌注模型作為肥厚心肌I-R損傷研究的小動(dòng)物模型；肥厚心肌的I-R損傷明顯較正常心肌嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為心功能下降明顯，心排出量減少，心肌超微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，心肌能量代謝受損，心肌炎癥反應(yīng)嚴(yán)重。 3.羅格列酮鈉預(yù)處理對(duì)大鼠肥厚心肌的I-R損傷具有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為心功能指標(biāo)改善，心肌超微結(jié)構(gòu)受損減

14、輕，心肌酶漏出減少，心肌ATP含量增加，促進(jìn)復(fù)氧心功能恢復(fù)等。羅格列酮鈉預(yù)處理對(duì)正常大鼠心肌I-R損傷的保護(hù)作用不明顯。 4.羅格列酮鈉預(yù)處理肥厚心肌，通過(guò)活化PPAR-γ抑制在心肌肥厚過(guò)程中NF-кB的過(guò)度激活，進(jìn)而通過(guò)上調(diào)I-кBα表達(dá)而抑制I-R后心肌I-кBα蛋白表達(dá)水平的降低，負(fù)反饋性的抑制I-R后肥厚心肌細(xì)胞NF-кB活性的升高；抑制TNF-αmRNA表達(dá)；減少肥厚心肌MPO含量，抑制炎癥反應(yīng)，從而對(duì)肥厚心肌I-R損