自主神經(jīng)調(diào)控在二尖瓣脫垂中的生物學(xué)意義及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分二尖瓣脫垂患者自主神經(jīng)功能評(píng)價(jià)
　　背景與目的:在發(fā)達(dá)的工業(yè)社會(huì),隨著風(fēng)濕性心臟病的逐年減少,二尖瓣脫垂已成為最為常見(jiàn)的心臟瓣膜病變,研究發(fā)現(xiàn)二尖瓣脫垂患者往往合并全身癥狀,并不能為單純的二尖瓣反流所解釋,可能和自主神經(jīng)功能狀態(tài)改變有關(guān)。本研究將從全身多系統(tǒng)對(duì)二尖瓣脫垂患者的自主神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià),并著重觀察研究瓣膜組織局部的神經(jīng)功能狀態(tài),全面系統(tǒng)地了解二尖瓣脫垂患者的自主神經(jīng)功能狀況。
　　方法:于瑞金醫(yī)院心臟外科(

2、2009.12-2011.12)連續(xù)隨機(jī)搜集二尖瓣脫垂及對(duì)照風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病變患者作為研究對(duì)象,通過(guò)改良COMPASS量表對(duì)病例進(jìn)行全身自主神經(jīng)功能評(píng)判,并檢測(cè)分析兩組病例血清自主神經(jīng)遞質(zhì):去甲腎上腺素及乙酰膽堿濃度,以及二尖瓣組織局部自主神經(jīng)纖維分布和主要特異受體的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:共納入二尖瓣脫垂患者38例和同期風(fēng)濕性二尖瓣反流患者40人,基本資料分析發(fā)現(xiàn)二尖瓣脫垂組中女性較對(duì)照組明顯增多(65.8％VS.32.4％,

3、P＜0.05),兩組入院時(shí)心功能(NYHA)及房顫等均無(wú)明顯差異。通過(guò)改良COMPASS量表評(píng)分,二尖瓣脫垂組得分,即陽(yáng)性癥狀發(fā)生率明顯高于對(duì)照組(4.08±0.97 VS.1.55±0.81,P＜0.01),二尖瓣脫垂組癥狀涉及范圍廣,除心血管系統(tǒng)外,皮溫調(diào)節(jié)、胃腸道癥狀亦較為突出,而對(duì)照組主要表現(xiàn)為心血管系統(tǒng)癥狀。ELISA結(jié)果顯示,二尖瓣脫垂患者血清去甲腎上腺素水平明顯較對(duì)照組升高(343.5±31 VS.254.5±25pg/m

4、L,p＜0.05),而乙酰膽堿濃度則降低尤為顯著(43±19 VS.75.8±11 nmol/L,p＜0.05)。免疫組化染色表明,兩組二尖瓣組織中均有酪氨酸羥化酶和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá),且相對(duì)表達(dá)量并無(wú)顯著差異,但兩組標(biāo)本中均以酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞較之膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽(yáng)性細(xì)胞為多;最后,我們發(fā)現(xiàn)二尖瓣脫垂組織中腎上腺素能β1、β2和α1受體及膽堿受體M2蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增多。
　　結(jié)論:本研究從生理功能、生物化學(xué)及分子生物學(xué)多

5、方面證實(shí)了二尖瓣脫垂患者自主神經(jīng)功能失衡,主要表現(xiàn)為交感神經(jīng)的相對(duì)或絕對(duì)亢進(jìn),而迷走神經(jīng)張力不足,尤以組織學(xué)表現(xiàn)最為突出,腎上腺素及膽堿受體均明顯上調(diào),從而不僅可對(duì)二尖瓣脫垂綜合癥的一系列癥狀作出合理的解釋,還提示自主神經(jīng)調(diào)控與疾病本身發(fā)生進(jìn)展之間的可能聯(lián)系。
　　第二部分基于自主神經(jīng)干預(yù)及基因轉(zhuǎn)染的二尖瓣脫垂大鼠模型的建立
　　背景與目的:二尖瓣脫垂的具體病因,進(jìn)展機(jī)制尚不明了,可能涉及基因表達(dá)異常致細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。然而二

6、尖瓣脫垂患者的自然病程具有相當(dāng)?shù)膫€(gè)體差異,這并不能為單純的基因異常所解釋,可能為后天環(huán)境因素影響。因二尖瓣脫垂常合并相當(dāng)?shù)淖灾魃窠?jīng)功能異常,因而本課題組將基于自主神經(jīng)干預(yù)及基因轉(zhuǎn)染,嘗試建立二尖瓣脫垂大鼠模型,進(jìn)一步明確自主神經(jīng)調(diào)控在二尖瓣脫垂發(fā)生、進(jìn)展中的地位。
　　方法;采用一周胎齡SD大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組、MMP2高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染)、自主神經(jīng)干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組(基因轉(zhuǎn)染+自主神經(jīng)干預(yù)),每組10只,相應(yīng)通過(guò)重組腺相關(guān)病毒rAA

7、V/MMP2心肌注射轉(zhuǎn)染及空瓶刺激法進(jìn)行自主神經(jīng)干預(yù),最后通過(guò)心臟超聲及組織特殊染色鑒定大鼠二尖瓣情況。
　　結(jié)果:空瓶法情緒刺激一月后,心率變異性結(jié)果表明,自主神經(jīng)干預(yù)組及聯(lián)合干預(yù)組較之對(duì)照組和MMP2高表達(dá)組的TP、HF、LF顯著降低,而LF/HF比值卻相對(duì)升高,符合自主神經(jīng)功能紊亂,交感亢進(jìn)為主的自主神經(jīng)狀態(tài)。經(jīng)過(guò)6個(gè)月干預(yù),心超發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干預(yù)組動(dòng)物二尖瓣后葉回聲增強(qiáng)增粗,輕度向左房脫出,而另外三組均無(wú)明顯改變,四組動(dòng)物心臟各

8、腔室及心功能亦無(wú)明顯變化。進(jìn)而對(duì)各組二尖瓣進(jìn)行組織學(xué)分析,聯(lián)合干預(yù)組二尖瓣后葉明顯交厚,并有局部增厚隆起。MASSON染色顯示聯(lián)合干預(yù)組膠原纖維異常排列,形態(tài)松散,結(jié)構(gòu)雜亂扭曲,瓣葉增厚區(qū)域膠原染色顯著減少:PAS多糖染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),聯(lián)合干預(yù)組中局限性隆起處主要含酸性粘多糖,擠壓侵犯致膠原纖維彈性纖維變形,扭曲,部分?jǐn)嗔选?br>　　結(jié)論:我們首次聯(lián)合自主神經(jīng)干預(yù)與基因轉(zhuǎn)染成功建立了二尖瓣脫垂大鼠模型,驗(yàn)證了自主神經(jīng)功能狀態(tài)在二尖瓣脫垂

9、發(fā)生進(jìn)展中的重要生物學(xué)意義,也將為二尖瓣脫垂的病因演進(jìn)研究揭開(kāi)新的篇章,為二尖瓣脫垂的臨床治療提供了新的思路和理論依據(jù)。
　　第三部分自主神經(jīng)遞質(zhì)(去甲腎上腺素、乙酰膽堿)對(duì)二尖瓣病理生理功能影響的體外研究
　　背景與目的:二尖瓣組織中存在相當(dāng)豐富的自主神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò),和瓣膜疾患病理生理過(guò)程密切相關(guān),本課題的前兩部分已然證實(shí)自主神經(jīng)調(diào)控在二尖瓣脫垂發(fā)生發(fā)展中的重要地位。然而自主神經(jīng)對(duì)二尖瓣哪些功能有著影響并不所知,因而本節(jié)將從

10、體外實(shí)驗(yàn)入手,探討自主神經(jīng)遞質(zhì):去甲腎上腺素和乙酰膽堿對(duì)瓣膜生物力學(xué)功能、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的作用及可能的分子機(jī)制,進(jìn)而揭示自主神經(jīng)對(duì)心臟瓣膜病理生理過(guò)程調(diào)控的具體機(jī)制。
　　方法:首先評(píng)價(jià)自主神經(jīng)遞質(zhì):去甲腎上腺素和乙酰膽堿對(duì)豬二尖瓣生物力學(xué)功能的影響,進(jìn)而觀察人二尖瓣瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖活性、表型,胞外基質(zhì)的生物合成及重塑功能對(duì)自主神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)以及相關(guān)信號(hào)通路的變化。
　　結(jié)果:從組織角度,去甲腎上腺素可明顯增加二尖

11、瓣的組織硬度,且呈濃度依賴(10-6、vs.10-7:周向:6.15±0.78vs.5.34±0.23,徑向:3.28±0.74 vs.2.64±0.39,p＜0.05;10-5 vs.10-6:周向:7.03±0.51 vs.6.15±0.78,徑向:4.32±0.99 vs.3.28±0.74,p＜0.05),但可被酚妥拉明、美托洛爾及脫內(nèi)皮預(yù)處理所部分抵消(p＜0.05);相反,乙酰膽堿則可顯著降低瓣膜的組織硬度,并和濃度相關(guān)(1

12、0-6 vs.對(duì)照:周向:4.35±0.76 vs.5.08±0.41,徑向:1.80±0.79 vs.2.40±0.10,p＜0.05:10-5 vs.10-6;周向:3.40±1.10vs.4.35±0.76,徑向:1.05±0.38 vs.1.80±0.79,p＜0.05),可被阿托品或經(jīng)脫內(nèi)皮預(yù)處理完全抵消。從細(xì)胞層面,梯度濃度的乙酰膽堿(10-2-103mmol/L)作用于二尖瓣間質(zhì)細(xì)胞,表現(xiàn)出活躍的增殖能力,隨濃度的增加而增

13、強(qiáng),在10mmol/L濃度時(shí)達(dá)到峰值,經(jīng)阿托品預(yù)處理后則部分抵消了其增殖作用;相反,去甲腎上腺素對(duì)細(xì)胞增殖則為抑制作用,可經(jīng)普萘洛爾預(yù)處理后逆轉(zhuǎn),酚妥拉明和哌唑嗪則只能削弱其抑制作用,可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ相關(guān),因?yàn)槿ゼ啄I上腺素可顯著抑制TGFβ的mRNA豐度,并呈濃度依賴(～11.5％),而乙酰膽堿則表現(xiàn)為增加其轉(zhuǎn)錄水平,最高達(dá)7.28％。然而,去甲腎上腺素可激活瓣膜間質(zhì)細(xì)胞,使胞體增寬,周?chē)黄鹪龆?細(xì)胞間接觸增加,SMA-α蛋

14、白表達(dá)明顯增強(qiáng)(～2.26倍,P＜0.05),可經(jīng)普萘洛爾、哌唑嗪和酚妥拉明部分抑制;乙酰膽堿則是減弱SMA蛋白的表達(dá),抑制了細(xì)胞活性,作用可被阿托品完全逆轉(zhuǎn)。對(duì)于細(xì)胞的生物合成能力,我們發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素可顯著減弱CollagenⅠ/ⅢmRNA的轉(zhuǎn)錄比例,而乙酰膽堿則是增加其基因轉(zhuǎn)錄;同樣隨著去甲腎上腺素濃度的遞增,細(xì)胞上清中糖胺多糖分泌呈上升趨勢(shì)(～3.05倍),而乙酰膽堿則表現(xiàn)為抑制其合成(減少～69.5％):兩種神經(jīng)遞質(zhì)均可增強(qiáng)彈

15、性蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄,只是去甲腎上腺素誘導(dǎo)生成的Elastin mRNA豐度增加幅度(～31.46％)較乙酰膽堿(～23％)更為顯著。另外去甲腎上腺素可誘導(dǎo)分泌型MMP2、總MMP2蛋白表達(dá)及其活性增強(qiáng),MMP9蛋白表達(dá)亦呈增強(qiáng)趨勢(shì),但其活性蛋白卻未被影響,乙酰膽堿則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì),可顯著減少分泌型MMP2、總MMP2蛋白表達(dá)及其活性,同樣MMP9蛋白表達(dá)亦被抑制,但未改變其活性形式的表達(dá);同時(shí)MMP2抑制物TIMP2的表達(dá)明顯被去甲