劑量效應(yīng)關(guān)系及肺癌細(xì)胞的部分功能狀態(tài)影響抗腫瘤藥物作用效果的研究.pdf

1、目的：
　　誘導(dǎo)分化為上個(gè)世紀(jì)70年代開始興起的腫瘤治療方法，最初應(yīng)用于急性早幼粒白血病的治療，以后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有誘導(dǎo)實(shí)體瘤分化的作用。就誘導(dǎo)分化而言，有的研究認(rèn)為細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期為誘導(dǎo)分化，也有研究認(rèn)為阻滯在S期或G2/M期為誘導(dǎo)分化。
　　全反式維甲酸是脂溶性維生素A在體內(nèi)的衍生物，亞硒酸鈉是微量元素硒的氧化物鹽。研究表明它們能誘導(dǎo)分化白血病細(xì)胞HL-60、NB4及肝癌細(xì)胞SMMC-7721，并且可以誘導(dǎo)一些肺癌細(xì)

2、胞的增殖率、粘附力、侵襲力下降。非實(shí)體瘤的誘導(dǎo)分化主要集中在紅白血病和白血病上進(jìn)行，實(shí)體瘤細(xì)胞對多種誘導(dǎo)分化劑可有程度不一的誘導(dǎo)反應(yīng)?？杀环只T導(dǎo)的實(shí)體腫瘤有:惡性黑色素瘤、胃癌、淋巴瘤、肺腺癌及鱗癌、骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、乳腺癌、星狀細(xì)胞瘤、絨毛膜上皮癌、膀胱癌、頭頸部癌、喉癌、前列腺癌及早期子宮頸癌等。
　　研究表明，不同腫瘤對誘導(dǎo)分化的反應(yīng)性很不一致，就肺癌而言，腺癌、鱗癌可以被誘導(dǎo)分化，而小細(xì)胞肺癌僅有少數(shù)的幾例關(guān)于

3、誘導(dǎo)分化方面的報(bào)道。Li等人研究了全反式維甲酸和受體亞型選擇性維甲酸對人肺癌細(xì)胞生長和凋亡的影響，全反式維甲酸能抑制Calu-6和H460的生長，同時(shí)誘導(dǎo)RARβ表達(dá)，但它們對H292，SKMES-1和H661肺癌細(xì)胞系無作用，并且在這些細(xì)胞中RARβ沒有被誘導(dǎo)表達(dá)。
　　為尋找周期變化的規(guī)律，實(shí)驗(yàn)選用A549細(xì)胞，以藥物全反式維甲酸、亞硒酸鈉研究劑量效應(yīng)關(guān)系對藥物作用效果的影響。
　　實(shí)驗(yàn)選用分化程度相異的A549、A2二

4、株細(xì)胞，以藥物全反式維甲酸、亞硒酸鈉來研究腫瘤分化程度對藥物作用效果的影響。
　　方法：
　　一、材料
　　肺腺癌細(xì)胞A549、肺囊性腺樣癌細(xì)胞A2購自中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所。全反式維甲酸、亞硒酸鈉是Sigma公司產(chǎn)品。Rb、c-myc鼠抗人單抗購自北京中杉公司。Sp-kit試劑盒、DAB液購自福州邁新公司。Western blot所用一抗（鼠抗人caspase3、p21、兔抗人RARα）購自北京中杉公司。羊抗鼠二抗購

5、自Sigma公司，羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司。引物采用primer3軟件設(shè)計(jì):(1) Bcl-2(151bp)，(2) cycl inD3(230bp),(3) nm23(192bp),(4) Stat3(202bp),(5)β-act in(513bp)。由TaKaRa公司合成，提取總RNA的RNAout由深圳華氏生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，RT-PCR試劑盒及DNA聚合酶均購自TaKaRa公司，電泳用聚丙烯酰胺、Tris，甘氨

6、酸及瓊脂糖等購自上海生工公司。
　　A549、A2細(xì)胞接種于含10％胎牛血清、PH值7.0-7.2的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)傳代、培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)所需數(shù)量。
　　全反式維甲酸溶于95％乙醇中配成10.0mmol/L貯存液，濾過除菌，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)前日用培養(yǎng)液稀釋至10倍所需濃度。亞硒酸鈉于實(shí)驗(yàn)前日用雙蒸水配成10.0mmol/L，濾過除菌后用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度10倍。處理藥物全反式維甲

7、酸、亞硒酸鈉濃度依不同指標(biāo)對細(xì)胞要求分別為:2.5μ mol/L、5.0μ mol/L、10.0μ mol/L、20.0μ mol/L、40.0μ mol/L。、80.0μ mol/L、160.0μ mol/L。薌藥物配制濃度一部分結(jié)合實(shí)驗(yàn)所需，一部分結(jié)合臨床應(yīng)用設(shè)計(jì)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測吸光度并篩選濃度
　　計(jì)算每種藥物不同濃度的增殖抑制率。
　　腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=（

8、對照孔平均OD值-實(shí)驗(yàn)孔平均OD值)/對照孔平均OD值×100％
　　2、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化及凋亡、壞死細(xì)胞比例
　　以流式細(xì)胞儀FACSCalibur，BD（美國）于FLA-2參數(shù)下檢測細(xì)胞周期，采集軟件Cell Quest3.0采樣，分析軟件ModFit LT3.0定量分析細(xì)胞周期各時(shí)期的百分率及凋亡、壞死細(xì)胞的百分率。
　　3、吖啶橙熒光染色觀察細(xì)胞凋亡及細(xì)胞形態(tài)變化
　　避光冷藏狀況下于熒光顯微鏡

9、下觀察并照相。激發(fā)熒光波長為450-490nm（綠熒光）。
　　4、倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)的變化
　　24小時(shí)后各孔于倒置顯微鏡下直接觀察并拍照。
　　5、 Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化
　　固定、染色、脫水、透明，中性樹膠封片后于400倍光鏡下觀察。
　　6、免疫組化SP法檢測癌基因、抑癌基因表達(dá)變化
　　免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，以黃色或棕色染色為陽性。

10、r>　　7、羅丹明123熒光染色觀察細(xì)胞線粒體改變
　　避光冷藏狀況下于熒光顯微鏡下觀察并照相。激發(fā)熒光波長為450-490nm（綠熒光）。
　　8、電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變
　　固定、染色、切片，H-600A型透射電鏡下觀察并拍照。
　　9、Western Blot法于翻譯水平檢測基因蛋白的表達(dá)
　　用GIS-2020凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。
　　10、 Rt-PCR法于轉(zhuǎn)錄水平檢測基

11、因mRNA的表達(dá)
　　以β-actin吸光度值標(biāo)化目的產(chǎn)物吸光度值，得到目的產(chǎn)物相對含量。
　　目的產(chǎn)物相對含量=強(qiáng)度（泳道1）/強(qiáng)度（泳道2）
　　抑癌基因上調(diào)比例=較對照上調(diào)抑癌基因例數(shù)/（較對照上調(diào)抑癌基因例數(shù)+較對照下調(diào)抑癌基因例數(shù)）×100％
　　癌基因下調(diào)比例=較對照下調(diào)癌基因例數(shù)/（較對照下調(diào)癌基因例數(shù)+較對照上調(diào)癌基因例數(shù)）×100％
　　11、數(shù)據(jù)處理
　　數(shù)據(jù)以（(x)±s）表示，

12、采用多因素方差分析:LSD法，Student-Newman-Keuls法（q檢驗(yàn)）做多重比較?？ǚ綑z驗(yàn):Kruskal-Wallis Test法，Median Test檢驗(yàn)?；虿糠謱φ战M樣本均數(shù)采用T檢驗(yàn)比較。SPSS14.0處理數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　藥物作用后，經(jīng)MTT檢測，處理組吸光度比對照組明顯降低，且呈現(xiàn)出濃度效應(yīng)關(guān)系;經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，處理組凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞碎片較對照組比例增加，且隨濃度增高而增多。隨濃度增加

13、，A549的二倍體細(xì)胞比例有所增加、異倍體細(xì)胞比例有所減少，A2（主要為多倍體）的異倍體細(xì)胞比例有所增加;倒置顯微鏡下觀察，處理組細(xì)胞折光度降低，細(xì)胞皺縮、破碎，邊緣不整;A2細(xì)胞集落化現(xiàn)象消失，形態(tài)由均一大小的小梭形變?yōu)槎喾N形態(tài)。Giemsa染色顯示A549細(xì)胞較對照組染色加深、分裂細(xì)胞減少、不對稱核分裂減少、細(xì)胞多形性減少;A2細(xì)胞較對照組體積增大、分裂細(xì)胞減少、梭形細(xì)胞增多、出現(xiàn)大量的多核巨細(xì)胞，集落化現(xiàn)象消失。經(jīng)吖啶橙熒光染色觀

14、察，隨藥物作用時(shí)間增加，A549處理組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。經(jīng)羅丹明123熒光染色觀察，A549、A2處理組線粒體熒光減少、強(qiáng)度降低，部分熒光顆粒變粗大。藥物作用后，A549、A2細(xì)胞在癌基因c-myc、抑癌基因Rb的表達(dá)上均與對照存在差異。c-myc的表達(dá)下降，A549細(xì)胞的Rb表達(dá)增高、A2細(xì)胞的Rb表達(dá)降低。經(jīng)電子顯微鏡觀察，處理組細(xì)胞線粒體腫脹、變圓、線粒體嵴模糊不清至線粒體空泡化改變、細(xì)胞表面絨毛脫落、核質(zhì)濃縮、出現(xiàn)凋亡和破碎細(xì)胞;免