桑葉穿孔病葉面生物種群的鑒定及致病性研究.pdf

1、桑樹是一種重要的經濟作物，其根、莖、葉、果實均具有較大的經濟價值，且桑葉是家蠶最好的天然飼料，桑樹為蠶桑業(yè)帶來了豐厚的收入。桑樹病害的發(fā)生嚴重制約了蠶桑業(yè)的發(fā)展。桑穿孔病是近些年來才受到關注的一種桑病，該病害的發(fā)生嚴重影響了桑葉產量和品質以及桑樹的生長。植物穿孔病主要由病原微生物引起的，感病植物的典型病征表現為葉片穿孔、脫落，同時對枝條和果實也有一定的影響。在2008年有研究報道了桑穿孔病的發(fā)生，但桑穿孔病的病因及病原體迄今尚不清楚。2

2、015年8月四川省綿陽市三臺縣的桑園發(fā)生了較大規(guī)模的桑樹穿孔病，同時還伴有大量微型害蟲的危害，這一復雜的生態(tài)現象給穿孔病發(fā)生的原因的準確診斷增加了難度。
　　本課題組成員于2015年三臺縣桑園爆發(fā)穿孔病時，前往該桑園進行了現場觀察和病葉樣本的采集，并進一步對受害葉面的微生物進行了分離、純化和鑒定，對葉面上分布的微型害蟲進行了調查和初步分類；根據科赫法則將分離得到的5種疑似病原菌 Pantoea agglomerans MB01、P

3、antoea ananatis MB02、Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06回接到健康的桑葉上，以檢測疑似病原菌的致病性，將產生穿孔癥狀的桑葉帶回實驗室進行病原菌的再分離，并將再分離菌株與3種接種菌株對比分析，確認為桑樹穿孔病病原菌。從已驗證的3株桑樹穿孔病病原菌中選擇致病性最強的菌株 Nigrospora sphaerica MF03，通

4、過觀察其生長周期和溫度、pH值、光照條件這三種因素對菌絲生長的影響以及測試菌絲的致死溫度來研究菌株的生物學特性。
　　本文的主要研究內容和實驗結果如下：
　　1病葉表面微生物的分離鑒定及微型害蟲調查
　　根據植物病原微生物的常規(guī)分離方法，從桑葉病斑組織分離到了若干菌株，再根據16S或者ITS鑒定為5株細菌，6株真菌。通過對16S rDNA或ITS rDNA基因片段的擴增與測序并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時結合形態(tài)特征將分離到的

5、細菌菌株分別鑒定并命名為： Pantoea agglomerans MB01、Pantoea ananatis MB02、Pseudomonas oryzihabitans MB03、 Pseudomonas argentinensis MB04以及Acinetobacter calcoaceticus MB05；分離到的真菌菌株分別鑒定并命名為：Nigrospora sp. MF01、Nigrospore oryzae MF02、Ni

6、grospora sphaerica MF03、Phanerochaete sordid MF04、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06。此外，本實驗中還觀察到在病桑葉表面分布著大量的微型害蟲，經過統(tǒng)計、調查，可將它們初步鑒定為桑薊馬、桑粉虱、葉螨和葉甲。
　　2疑似病原菌的致病性試驗
　　結合文獻資料，本研究從分離得到的菌株中選擇2株疑似植物致病性細菌：Pantoea agglo

7、merans MB01、Pantoea ananatis MB02以及3株真菌：Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06進行科赫試驗，將疑似病原菌回接到健康的桑葉表面以檢測分析。結果顯示，細菌分離株沒有引起桑葉發(fā)?。欢婢囼灧譃樯Ｈ~創(chuàng)傷和無創(chuàng)傷兩種處理，3株真菌接種無創(chuàng)傷處理的桑葉后，雖能低頻率地感染桑葉使其產生病斑但均不產生穿孔癥狀；3株真菌

8、接種創(chuàng)傷處理的桑葉后均能引起桑葉產生典型的穿孔癥狀，且以菌株 Nigrospora sphaerica MF03的致病性最高，在夏秋兩季接種桑葉都能引起非常高的穿孔率。另外兩株真菌Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06在夏季接種桑葉能引發(fā)非常高的穿孔率，而在秋季接種桑葉僅能引起桑葉發(fā)生病斑卻不能出現穿孔現象。同時對接種后產生典型穿孔癥狀的桑葉進行病原菌的再分離，并將再分離的菌株的ITS rDNA

9、序列、形態(tài)特征分別與原接種菌株對比，比較分析結果表明再分離菌株與原接種菌株一致。因此綜合以上研究結果可確定這3株真菌 Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06均能引起桑葉穿孔。
　　3致病性菌株Nigrospora sphaerica MF03的生物學特性研究
　　基于致病性試驗結果，選擇致病性最高的真菌菌株Nigrospora sp

10、haerica MF03為目的菌株并進一步研究該菌株的生物學特性，以期為桑葉穿孔病的防治提供基礎數據與參考。通過檢測菌株的生長周期和溫度、pH值、光照條件對菌絲生長的影響以及測定菌絲的致死溫度，研究結果顯示在實驗室條件下未觀察到菌株Nigrospora sphaerica MF03的有性生殖周期，初步確定該菌通過孢子進行繁殖的。菌絲對生長溫度、pH值表現出較大的耐受范圍，但培養(yǎng)溫度高于35℃或pH值小于2.0時菌絲不能生長；且菌絲生長不