桑葉穿孔病葉面生物種群的鑒定及致病性研究.pdf

1、桑樹(shù)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根、莖、葉、果實(shí)均具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且桑葉是家蠶最好的天然飼料，桑樹(shù)為蠶桑業(yè)帶來(lái)了豐厚的收入。桑樹(shù)病害的發(fā)生嚴(yán)重制約了蠶桑業(yè)的發(fā)展。桑穿孔病是近些年來(lái)才受到關(guān)注的一種桑病，該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了桑葉產(chǎn)量和品質(zhì)以及桑樹(shù)的生長(zhǎng)。植物穿孔病主要由病原微生物引起的，感病植物的典型病征表現(xiàn)為葉片穿孔、脫落，同時(shí)對(duì)枝條和果實(shí)也有一定的影響。在2008年有研究報(bào)道了桑穿孔病的發(fā)生，但桑穿孔病的病因及病原體迄今尚不清楚。2

2、015年8月四川省綿陽(yáng)市三臺(tái)縣的桑園發(fā)生了較大規(guī)模的桑樹(shù)穿孔病，同時(shí)還伴有大量微型害蟲(chóng)的危害，這一復(fù)雜的生態(tài)現(xiàn)象給穿孔病發(fā)生的原因的準(zhǔn)確診斷增加了難度。
　　本課題組成員于2015年三臺(tái)縣桑園爆發(fā)穿孔病時(shí)，前往該桑園進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)觀察和病葉樣本的采集，并進(jìn)一步對(duì)受害葉面的微生物進(jìn)行了分離、純化和鑒定，對(duì)葉面上分布的微型害蟲(chóng)進(jìn)行了調(diào)查和初步分類(lèi)；根據(jù)科赫法則將分離得到的5種疑似病原菌 Pantoea agglomerans MB01、P

3、antoea ananatis MB02、Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06回接到健康的桑葉上，以檢測(cè)疑似病原菌的致病性，將產(chǎn)生穿孔癥狀的桑葉帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的再分離，并將再分離菌株與3種接種菌株對(duì)比分析，確認(rèn)為桑樹(shù)穿孔病病原菌。從已驗(yàn)證的3株桑樹(shù)穿孔病病原菌中選擇致病性最強(qiáng)的菌株 Nigrospora sphaerica MF03，通

4、過(guò)觀察其生長(zhǎng)周期和溫度、pH值、光照條件這三種因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響以及測(cè)試菌絲的致死溫度來(lái)研究菌株的生物學(xué)特性。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1病葉表面微生物的分離鑒定及微型害蟲(chóng)調(diào)查
　　根據(jù)植物病原微生物的常規(guī)分離方法，從桑葉病斑組織分離到了若干菌株，再根據(jù)16S或者ITS鑒定為5株細(xì)菌，6株真菌。通過(guò)對(duì)16S rDNA或ITS rDNA基因片段的擴(kuò)增與測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)結(jié)合形態(tài)特征將分離到的

5、細(xì)菌菌株分別鑒定并命名為： Pantoea agglomerans MB01、Pantoea ananatis MB02、Pseudomonas oryzihabitans MB03、 Pseudomonas argentinensis MB04以及Acinetobacter calcoaceticus MB05；分離到的真菌菌株分別鑒定并命名為：Nigrospora sp. MF01、Nigrospore oryzae MF02、Ni

6、grospora sphaerica MF03、Phanerochaete sordid MF04、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06。此外，本實(shí)驗(yàn)中還觀察到在病桑葉表面分布著大量的微型害蟲(chóng)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)、調(diào)查，可將它們初步鑒定為桑薊馬、桑粉虱、葉螨和葉甲。
　　2疑似病原菌的致病性試驗(yàn)
　　結(jié)合文獻(xiàn)資料，本研究從分離得到的菌株中選擇2株疑似植物致病性細(xì)菌：Pantoea agglo

7、merans MB01、Pantoea ananatis MB02以及3株真菌：Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06進(jìn)行科赫試驗(yàn)，將疑似病原菌回接到健康的桑葉表面以檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，細(xì)菌分離株沒(méi)有引起桑葉發(fā)??；而真菌試驗(yàn)分為桑葉創(chuàng)傷和無(wú)創(chuàng)傷兩種處理，3株真菌接種無(wú)創(chuàng)傷處理的桑葉后，雖能低頻率地感染桑葉使其產(chǎn)生病斑但均不產(chǎn)生穿孔癥狀；3株真菌

8、接種創(chuàng)傷處理的桑葉后均能引起桑葉產(chǎn)生典型的穿孔癥狀，且以菌株 Nigrospora sphaerica MF03的致病性最高，在夏秋兩季接種桑葉都能引起非常高的穿孔率。另外兩株真菌Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06在夏季接種桑葉能引發(fā)非常高的穿孔率，而在秋季接種桑葉僅能引起桑葉發(fā)生病斑卻不能出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象。同時(shí)對(duì)接種后產(chǎn)生典型穿孔癥狀的桑葉進(jìn)行病原菌的再分離，并將再分離的菌株的ITS rDNA

9、序列、形態(tài)特征分別與原接種菌株對(duì)比，比較分析結(jié)果表明再分離菌株與原接種菌株一致。因此綜合以上研究結(jié)果可確定這3株真菌 Nigrospora sphaerica MF03、Phomopsis sp. MF05和Epicoccum nigrum MF06均能引起桑葉穿孔。
　　3致病性菌株Nigrospora sphaerica MF03的生物學(xué)特性研究
　　基于致病性試驗(yàn)結(jié)果，選擇致病性最高的真菌菌株Nigrospora sp

10、haerica MF03為目的菌株并進(jìn)一步研究該菌株的生物學(xué)特性，以期為桑葉穿孔病的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與參考。通過(guò)檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)周期和溫度、pH值、光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響以及測(cè)定菌絲的致死溫度，研究結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)室條件下未觀察到菌株Nigrospora sphaerica MF03的有性生殖周期，初步確定該菌通過(guò)孢子進(jìn)行繁殖的。菌絲對(duì)生長(zhǎng)溫度、pH值表現(xiàn)出較大的耐受范圍，但培養(yǎng)溫度高于35℃或pH值小于2.0時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)；且菌絲生長(zhǎng)不