中華倒刺鲃神經(jīng)肽Y的cDNA克隆與序列分析.pdf

1、神經(jīng)肽Y(NeuropeptideY，NPY)是一種由36個(gè)氨基酸組成的多肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，尤其在端腦、視前區(qū)、視頂蓋以及下丘腦含量豐富。NPY與攝食行為、血壓、生物節(jié)律性、呼吸調(diào)節(jié)、下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌功能以及血管收縮，平滑肌舒縮等重要的生理過(guò)程的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。中華倒刺鲃(Barbodes(Spinibarbus)smensis)，主要分布于長(zhǎng)江中上游的干、支流水域中，是我國(guó)名貴淡水野生經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，具有巨大的養(yǎng)殖開(kāi)

2、發(fā)前景。NPY是一種十分重要的采食量調(diào)控因子，但目前還沒(méi)有研究從分子水平具體闡明NPY對(duì)中華倒刺鲃攝食的作用機(jī)制，研究中華倒刺鲃NPY基因可以填補(bǔ)中華倒刺鲃NPY研究的欠缺，為進(jìn)一步探討NPY在促進(jìn)中華倒刺鲃攝食上發(fā)揮的作用建立一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，以期為中華倒刺鲃等名優(yōu)魚(yú)類的養(yǎng)殖過(guò)程中的生物飼料技術(shù)提供理論或現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)該研究對(duì)于闡明脊椎動(dòng)物NPY基因的分子進(jìn)化也有一定的學(xué)術(shù)意義。 本研究運(yùn)用RACE技術(shù)克隆了中華倒刺鲃NP

3、Y基因，并對(duì)其核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列以及預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)果如下： 1.中華倒刺鲃NPY基因全長(zhǎng)cDNA序列 在對(duì)多種鯉科魚(yú)類的NPY基因進(jìn)行了多重比對(duì)后設(shè)計(jì)了兩條特異性3'RACE引物，以來(lái)自中華倒刺鲃腦組織的mRNA為模板擴(kuò)增得到了中華倒刺鲃NPY3'端序列。根據(jù)得到的3’端序列設(shè)計(jì)了一條特異性反轉(zhuǎn)錄引物和三對(duì)5'RACE特異性引物，從而得到了中華倒刺鲃NPY的5’端序列。分別從得到的3

4、’端序列和5’端序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增中華倒刺鲃NPY全長(zhǎng)cDNA。中華倒刺鲃NPY全長(zhǎng)cDNA為774bp，5'UTR長(zhǎng)為65bp，編碼區(qū)包括291個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)長(zhǎng)96個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)前體，3'UTR長(zhǎng)為418bp。 2.中華倒刺鲃基因推導(dǎo)氨基酸序列的分析 中華倒刺鲃NPY的cDNA編碼區(qū)核苷酸長(zhǎng)度為291bp，編碼96個(gè)氨基酸，由信號(hào)肽(28個(gè)氨基酸)、NPY成熟肽(36個(gè)氨基酸)、三肽加工位點(diǎn)(3個(gè)氨基酸)

5、和連接肽(29個(gè)氨基酸)組成。其基因基本結(jié)構(gòu)和從其它脊椎動(dòng)物中克隆的NPY的基因結(jié)構(gòu)一致。 3.中華倒刺鲃NPY基因的同源性分析 中華倒刺鲃NPY的核苷酸序列與許多動(dòng)物的NPY基因具有較強(qiáng)的相似性。尤其是在保守區(qū)內(nèi)。比如其2bp-540bp、683bp-754bp和76bp-654bp區(qū)段與鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)的NPY基因(AF287347)的5bp-553bp、659bp-730bp和563bp-641

6、bp區(qū)段分別有95﹪、93﹪和91﹪的一致性，在DNAMAN軟件上對(duì)這兩者的cDNA全序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，這兩個(gè)基因在整體分子水平上有86.5﹪的核苷酸一致性。中華倒刺鲃NPY的cDNA序列的編碼區(qū)與鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)、金魚(yú)(Carassiusauratus)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)NPY的cDNA序列的編碼區(qū)的一致性為97.25﹪、95.56﹪、91.75﹪，全序列的一致性為85.6﹪、47.3﹪、5

7、2.21﹪。 中華倒刺鲃NPY在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性。中華倒刺鲃NPY前體氨基酸與鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)、金魚(yú)(Carassiusauratus)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)等鯉科魚(yú)類NPY前體氨基酸之間的相似性很高，分別為97﹪、97﹪、95﹪；與其它硬骨魚(yú)類如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)、斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus

8、coioides)的相似性分別為78﹪、76﹪、77﹪，而與兩棲類的光滑爪蛙、哺乳類的綿羊以及人的相似性分別為77﹪、83﹪、78﹪。 將幾種代表不同脊椎動(dòng)物類群的NPY前體氨基酸序列運(yùn)用軟件比較發(fā)現(xiàn)：不同物種間NPY的相似性很高，尤其是由36個(gè)氨基酸編碼的NPY成熟肽之間的相似性更高。不同物種間NPY的比對(duì)結(jié)果表明，NPY前體的成熟肽和蛋白水解位點(diǎn)是十分保守的，而信號(hào)肽和連接肽有較大的變異。由此可以推測(cè)NPY是一個(gè)比較古老的分

9、子，不同物種間的NPY可能是由相同的祖先進(jìn)化而來(lái)的，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中NPY成熟肽及蛋白水解位點(diǎn)序列進(jìn)化很保守，而在不同進(jìn)化分支脊椎動(dòng)物之間，NPY信號(hào)肽和連接肽的氨基酸序列變化較大，這可能與不同物種在長(zhǎng)期的自然選擇壓力有關(guān)。 4.中華倒刺鲃NPY基因推導(dǎo)蛋白的分析及其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)NPY基因編碼一個(gè)96個(gè)氨基酸的多肽鏈，分子量Mw=11.0046kDa，等電點(diǎn)pI=5.59。在氨基酸組成上，亮氨酸(Leu)是含量最高的

10、氨基酸(11.46﹪)；其次是丙氨酸(Ala)，占8.33﹪；再次是谷氨酸(Glu)和蘇氨酸(Thr)，均占7.29﹪；含量最低的氨基酸是半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)和纈氨酸(Val)，均為2.08﹪。從整體上來(lái)看，堿性氨基酸(賴氨酸Lys、精氨酸Arg)和酸性氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)分別占9.38﹪和12.5﹪，酸性氨基酸含量的偏高是導(dǎo)致其等低等電點(diǎn)的原因。該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有四種形式組成，及α-螺旋、隨機(jī)