內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞募集機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:移植物動脈病是目前器官移植發(fā)生慢性失功的共同病理變化,也是影響移植物長期存活的一個最重要因素。其主要的病理特征是移植物動脈廣泛新生內(nèi)膜增生,從而致使移植物動脈在移植后的數(shù)月至數(shù)年間出現(xiàn)管腔狹窄,引起移植器官的缺血缺氧和實(shí)質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致移植器官功能喪失。近年來的研究發(fā)現(xiàn),新生內(nèi)膜絕大部分由平滑肌樣細(xì)胞構(gòu)成。新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞和傳統(tǒng)意義上的血管中膜平滑肌細(xì)胞不同,其中最為重要就是新生內(nèi)膜中的平滑肌樣細(xì)胞高度表達(dá)中膜平滑肌細(xì)胞

2、表面沒有的CCR1。多種動物模型研究顯示,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、中膜平滑肌細(xì)胞、血管外膜細(xì)胞及血管周圍基質(zhì)等都有可能存在新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞的前體細(xì)胞。這些前體細(xì)胞通過不同粘附或者遷移途徑,定居在新生內(nèi)膜,分裂增殖,引起新生內(nèi)膜過度增生,移植物動脈管腔狹窄。有研究表明,IFN-γ能夠刺激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種趨化因子,其中RANTES很可能參與了炎癥反應(yīng)時,各種炎癥細(xì)胞的滲出過程;還有研究表明 RANTES可能參與了移植物動脈病的發(fā)生發(fā)展。但

3、是平滑肌樣細(xì)胞的前體細(xì)胞遷移至新生內(nèi)膜的機(jī)制,目前尚不清楚。因此研究新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞的募集機(jī)制可以為今后治療和預(yù)防移植物動脈病提供新的靶點(diǎn)。
　　目的:檢測內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子 RANTES能否誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞或新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞的遷移。探討內(nèi)皮細(xì)胞參與移植物動脈病內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞募集的機(jī)制。
　　方法:采用酶消化法和磁珠分選法原代培養(yǎng)小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞和主動脈中膜平滑肌細(xì)胞,采用持續(xù)擴(kuò)增法純化內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞;

4、建立小鼠主動脈移植模型,采用酶消化法和持續(xù)細(xì)胞擴(kuò)增法分離純化新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞;流式細(xì)胞技術(shù)鑒定新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞;采用微流體實(shí)驗(yàn)裝置模擬在體血管各層細(xì)胞生長;并與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Boyden chamber實(shí)驗(yàn)相比較,確定微流裝置的實(shí)用性和有效性;采用IFN-γ刺激內(nèi)皮細(xì)胞,Elisa方法檢測并確定內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子;微流裝置內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞,檢測 IFN-γ刺激內(nèi)皮細(xì)胞后誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞和/或平滑肌樣細(xì)胞

5、的遷移;采用siRNA方法抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子并用Elisa方法檢測抑制效果;采用微流體裝置檢測siRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子后,IFN-γ激活的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)平滑肌樣細(xì)胞的遷移。
　　結(jié)果:酶消化法和磁珠分選法能夠有效分離培養(yǎng)出小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞和主動脈中膜平滑肌細(xì)胞。小鼠動脈移植模型是得到內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞很好的方法,并能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的純度。微流體裝置相比傳統(tǒng)觀察細(xì)胞遷移的劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden chamber實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞遷移

6、的研究更直觀、更敏感、更準(zhǔn)確。siRNA方法能夠明顯抑制IFN-γ刺激活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子。IFN-γ刺激活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子 RANTES能夠誘導(dǎo)平滑肌樣細(xì)胞遷移,但不能誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞的遷移。
　　結(jié)論：IFN-γ能夠刺激活化內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子 RANTES。趨化因子RANTES能夠誘導(dǎo)移植物動脈新生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞而不是正常動脈中膜平滑肌細(xì)胞的遷移,活化內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子 RANTES可能在移植物動脈新

7、生內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞募集的過程中有重要作用。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞、主動脈中膜平滑肌細(xì)胞以及移植動脈內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　目的：原代培養(yǎng)小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞、主動脈中膜平滑肌細(xì)胞和移植動脈內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞,細(xì)胞鑒定。方法：采用酶消化法聯(lián)合磁珠分選的方法培養(yǎng)小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞、主動脈中膜平滑肌細(xì)胞,酶消化法培養(yǎng)移植動脈內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞,采用持續(xù)細(xì)胞擴(kuò)增法純化上述細(xì)胞,流式

8、細(xì)胞技術(shù)鑒定平滑肌樣細(xì)胞,比較平滑肌細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的生長情況,對胰酶消化,凍存后復(fù)蘇的情況。結(jié)果：酶消化法聯(lián)合磁珠分選的方法可以高效原代培養(yǎng)上述細(xì)胞,細(xì)胞狀態(tài)好,純度高。平滑肌樣細(xì)胞比平滑肌細(xì)胞增殖速度快,二者胰酶的耐受性較內(nèi)皮細(xì)胞好,內(nèi)皮細(xì)胞粘附所需時間短,對凍存后的耐受性較好。結(jié)論：酶消化法聯(lián)合磁珠分選的方法能夠很好的培養(yǎng)原代內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞,持續(xù)細(xì)胞擴(kuò)增法是一種有效的純化原代細(xì)胞的方法。上述三種細(xì)

9、胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖、黏附、對胰酶的反應(yīng)以及凍存后復(fù)蘇都存在差異。
　　第二部分 新型微流體裝置的實(shí)驗(yàn)室制備及其應(yīng)用于觀察平滑肌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的效能鑒定
　　目的：實(shí)驗(yàn)室制備新型微流體實(shí)驗(yàn)裝置,并通過與傳統(tǒng)平滑肌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行比較,確定其對平滑肌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的效能。方法：應(yīng)用40ng/ml絲裂霉素 C預(yù)處理實(shí)驗(yàn)用平滑肌細(xì)胞,分別用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),Boyden chamber穿梭小室實(shí)驗(yàn)以及新型微流體實(shí)驗(yàn)裝置,檢測平滑肌細(xì)胞的

10、遷移能力,比較三種實(shí)驗(yàn)方法的效能。結(jié)果：平滑肌細(xì)胞受絲裂霉素 C預(yù)處理后,未見明顯增殖。新型微流體裝置可檢測低濃度 PDGF(5ng/ml)趨化的平滑肌細(xì)胞定向遷移;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden chamber穿梭小室實(shí)驗(yàn)不能檢測低濃度 PDGF的趨化作用,且無法鑒別細(xì)胞遷移和細(xì)胞無規(guī)則化學(xué)運(yùn)動。結(jié)論：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden chamber檢測細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)方法,能夠早期檢測分辨細(xì)胞對不同趨化因子的遷移速度。微流體實(shí)驗(yàn)裝置能夠長時間觀

11、察細(xì)胞遷移,動態(tài)觀察細(xì)胞遷移,對細(xì)胞遷移的觀察和檢測比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法敏感性更好,更直觀。
　　第三部分 IFN-γ預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)平滑肌樣細(xì)胞遷移的研究
　　目的：應(yīng)用IFN-γ預(yù)刺激原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞,研究內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)平滑肌樣細(xì)胞遷移的機(jī)制。方法：采用IFN-γ或者 IFN-γ聯(lián)合相關(guān) siRNA對原代培養(yǎng)的心臟內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激24h,把這種已經(jīng)活化內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液和平滑肌細(xì)胞以及平滑肌樣細(xì)胞種植與微流體實(shí)驗(yàn)裝置

12、共培養(yǎng)48h,然后應(yīng)用Hoechst33342對微流體實(shí)驗(yàn)裝置中的細(xì)胞核進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下觀察,并應(yīng)用MATLAB軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果：IFN-γ預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞能夠誘導(dǎo)平滑肌樣細(xì)胞遷移,卻不能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移。IFN-γ聯(lián)合 RANTES siRNA預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞既不能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移也不能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移。結(jié)論：IFN-γ預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞能夠分泌 RANTES趨化因子,并且 RANTES可能參與了內(nèi)膜平滑肌樣細(xì)胞的遷