注射用重組人CTLA4-抗體融合蛋白Ⅰ期臨床試驗(yàn).pdf

1、注射用重組人CTLA4-抗體融合蛋白是一種由人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4）胞外區(qū)和人免疫球蛋白G1（IgG1）修飾的Fc片段（鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)）相連接的融合蛋白。它是一種選擇性共刺激調(diào)節(jié)劑，它與抗原提呈細(xì)胞上的B7分子的親和力大大高于T細(xì)胞表面的CD28，可以封閉抗原提呈細(xì)胞上的B7，阻斷CD28與之結(jié)合，從而阻斷共刺激通路，抑制T細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞）激活。T淋巴細(xì)胞的激活與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的病理進(jìn)程相關(guān)。在RA

2、患者的關(guān)節(jié)腔滑液中可以找到激活的T淋巴細(xì)胞。根據(jù)我國藥品食品監(jiān)督管理局（SFDA）通過的《藥品注冊(cè)管理辦法》，注射用重組人CTLA4-抗體融合蛋白屬于生物制品7類，即已在國外上市銷售但尚未在國內(nèi)上市銷售的生物制品。
　　目的：
　　建立酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法測(cè)定人血漿中重組人CTLA4-Ig濃度的方法，進(jìn)行單次給藥后重組人CTLA4-Ig在健康人體內(nèi)的耐受性和藥代動(dòng)力學(xué)研究，為指導(dǎo)臨床制定安全、合理的用藥方案提供理

3、論依據(jù)，為新藥審批和臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)，并為Ⅱ期臨床研究提供參考依據(jù)。
　　方法：本研究分以下三部分：
　　第一部分建立靈敏度高、專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、重復(fù)性強(qiáng)的ELISA法測(cè)定人血漿中rhCTLA4-Ig的分析方法學(xué)。測(cè)定步驟：將鼠抗人CTLA4單抗用包被緩沖液按比例稀釋，包被96孔酶標(biāo)板，4℃孵育18小時(shí)；加包被緩沖液室溫封閉2小時(shí)；用洗滌液洗板；加入不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋好的待測(cè)樣品；加樣后立即加入稀釋好的生物素標(biāo)

4、記的二抗。酶標(biāo)板置于搖床中連續(xù)振搖，室溫孵育2小時(shí)。加入按比例稀釋好的HRP標(biāo)記的鏈酶親和素。酶標(biāo)板置于搖床中連續(xù)振搖，室溫孵育0.5小時(shí)。避光條件下加入HRP顯色液，室溫反應(yīng)15分鐘。加終止液，終止反應(yīng)后0.5小時(shí)內(nèi)酶標(biāo)儀讀取450nm的吸光度（A）值，記錄結(jié)果。每份樣品重復(fù)測(cè)定，各藥盒都設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，用以計(jì)算未知樣品濃度。
　　第二部分考察單次靜脈滴注rhCTLA4-Ig（1～20mg·kg-1）在健康受試者體內(nèi)的耐受性。

5、隨機(jī)選取27名健康志愿者，年齡、體重、身高均符合試驗(yàn)要求，常規(guī)體檢、心電圖檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查包括血、尿常規(guī)，肝、腎功能等各項(xiàng)生化檢查均無異常，無其它系統(tǒng)性疾病及藥物過敏史。3個(gè)月內(nèi)未參加過臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)前兩周內(nèi)及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物。試驗(yàn)中隨時(shí)觀察受試者癥狀、體征以及各種不良反應(yīng)，并定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查（血尿常規(guī)、肝腎功能、血液生化及血沉等）。綜合評(píng)價(jià)rhCTLA4-Ig在健康人體內(nèi)的耐受性，整個(gè)試驗(yàn)期間配備有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師和護(hù)士監(jiān)護(hù)。所

6、有計(jì)量資料均采用Excel或SPSS軟件進(jìn)行計(jì)算，以?X±SD表示，并進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。
　　第三部分研究單次靜脈滴注rhCTLA4-Ig（1～20mg·kg-1）在健康受試者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。27名健康受試者隨機(jī)平行分為低、中、高3個(gè)單次給藥劑量組。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，27名受試者于試驗(yàn)當(dāng)日晨按分組分別靜脈滴注重組人CTLA4-抗體融合蛋白1mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1，輸液在（60±5）分鐘內(nèi)完成

7、，而后按設(shè)計(jì)的采血時(shí)間點(diǎn)采血。分別于靜脈滴注前、滴注開始第30分鐘，滴注結(jié)束后0、2、4、12、24小時(shí)、2、3、4、7、14、28、42、56、70和84天各取血2ml，置于15％EDTA抗凝的試管內(nèi)，3600r·min-1離心分離血清至另一無菌試管中，-80℃保存，待測(cè)。本試驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定血漿中rhCTLA4-Ig的濃度。采用DAS2.1軟件計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Tmax、Cmax采用實(shí)測(cè)值，AUC用公式計(jì)算。所有的數(shù)據(jù)均

8、用幾何均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（?X±SD）表示，采用單因素ANOVA和Student’sttest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.27名健康受試者，均完成試驗(yàn)。單次給藥耐受性試驗(yàn)觀察至84d。試驗(yàn)期間，全部試驗(yàn)的27名受試者應(yīng)用不同劑量藥物后均未有明顯的不良反應(yīng)發(fā)生；呼吸、心率、血壓、脈搏、體溫等生命體征未見異常；心電圖正常。注射藥物局部未發(fā)現(xiàn)皮膚紅腫、瘀斑或皮疹等刺激性反應(yīng)，試驗(yàn)觀察期間未出現(xiàn)不適反應(yīng)和異常體征。
　　2

9、.單次靜脈滴注rhCTLA4-Ig1、10和20mg·kg-1后觀察至84d。試驗(yàn)過程中共進(jìn)行七次血液生化指標(biāo)檢查。27名健康受試者用藥前后血沉檢查未發(fā)現(xiàn)異常改變，經(jīng)t檢驗(yàn)，各指標(biāo)試驗(yàn)前后比較均無顯著差異。試驗(yàn)前后進(jìn)行尿常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，所有健康受試者尿常規(guī)指標(biāo)無異常改變。
　　3.本試驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定健康志愿者血漿中rhCTLA4-Ig濃度，最低檢測(cè)限為0.4ng·mL-1，線性范圍為1.95～500ng·mL-1。本藥在此線

10、性范圍內(nèi)重現(xiàn)性好，CV％均小于10％，準(zhǔn)確度在-5.3～-1.1％之間；不同藥盒的批間精密度CV％也均小于10％，準(zhǔn)確度在0.6～6.2％之間。
　　4.單次靜脈滴注rhCTLA4-Ig1、10和20mg·kg-1后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：T1/2ke分別為（15.13±2.62）,（14.21±2.35）和（11.77±1.24）d；MRT分別為（19.913±2.086）、（19.630±1.832）和（18.795±0.832）d

11、；AUC(0-84d)分別為（170.64±27.75）、（1490.26±231.23）和（2977.25±362.31）μg·d·mL-1；Tmax均為0.0416d；Cmax分別為（18.39±1.57）,（186.91±24.70）和（416.84±34.40）μg·mL-1。
　　結(jié)論：
　　1.ELISA的分析方法具有靈敏度較高，準(zhǔn)確性好，專一性較強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便快捷、可重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)。高、中、低三種濃度樣品-80℃

12、凍存一個(gè)月后，CTLA4-Ig穩(wěn)定性良好，與未經(jīng)凍存的樣本相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異。適用于人體血漿中rhCTLA4-Ig的定量分析。
　　2.試驗(yàn)表明健康受試者單次靜脈滴注國產(chǎn)rhCTLA4-Ig在1～20mg·kg-1劑量范圍內(nèi)是安全的，耐受性良好，未見不良反應(yīng)發(fā)生。
　　3.用本方法測(cè)定受試者血漿rhCTLA4-Ig濃度，內(nèi)源性抗CTLA4-Ig抗體干擾低于LOQ。血藥濃度隨注射劑量增高而升高。各劑量組的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)基