苯甲酸雌二醇對(duì)慢性腦缺血大鼠的保護(hù)作用研究.pdf

1、背景和目的 慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見(jiàn)病理狀態(tài)，伴發(fā)于腦動(dòng)脈硬化、血管性癡呆(Vascular dementia vD)、Binswanger病及A1zheimer’s病(AD)等多種疾病的病理過(guò)程中，發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)，最終可導(dǎo)致持久或進(jìn)展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙。大量研究證實(shí)，慢性腦缺血引起的神經(jīng)元缺失、白質(zhì)損害可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。海馬是參與學(xué)習(xí)和記憶的重要結(jié)構(gòu)，因此海馬神經(jīng)元缺失可引起學(xué)習(xí)和記憶能力受損。中

2、樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，研究表明作為該系統(tǒng)的標(biāo)志酶一膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Ch01．ineacetyl-transferase，CHAT)活性降低是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因。學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)解剖基礎(chǔ)是突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，而一氧化氮(NO)和突觸素(synaptophysin，SYN)與神經(jīng)突觸的可塑性密切相關(guān)。 流行病學(xué)資料表明，絕經(jīng)前的女性比同年齡男性的卒中發(fā)生率低，且卒中的嚴(yán)重程度遠(yuǎn)低于同年齡男性和絕經(jīng)后女性，但絕經(jīng)后女性其

3、卒中的發(fā)生率迅速增高。在對(duì)女性絕經(jīng)后雌激素替代治療的研究中發(fā)現(xiàn)，替代治療可以使發(fā)生卒中的相對(duì)危險(xiǎn)度下降，與卒中有關(guān)的死亡率亦下降。由此，人們推測(cè)雌激素具有腦保護(hù)作用。近幾年來(lái)，科研工作者發(fā)現(xiàn)雌激素不僅降低腦損害的嚴(yán)重程度而且改善認(rèn)知功能。但是在已有慢性腦灌注不足的情況下，雌激素有無(wú)保護(hù)作用，如何表現(xiàn)，目前研究較少。 本試驗(yàn)旨在通過(guò)永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈即(2VO法)建立大鼠慢性腦缺血模型，經(jīng)腹腔內(nèi)注射雌激素，用MG-2Y型迷宮比

4、較大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并通過(guò)免疫組化方法觀察海馬CA1區(qū)突觸素、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)的變化，初步探討雌激素對(duì)慢性腦缺血認(rèn)知功能影響的機(jī)制，為臨床上預(yù)防及治療與慢性腦缺血有關(guān)的疾病提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。 材料與方法1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：健康成年雌性SD大鼠30只，體重300-350g(河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組：?jiǎn)渭內(nèi)毖M；缺血治療組。每組10只。缺血治療組大鼠卵巢切除術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始腹腔

5、注射苯甲酸雌二醇1mg/kg，(0.3ml)；假手術(shù)組和單純?nèi)毖M大鼠術(shù)后給予煮沸冷卻后的麻油(溶解雌二醇的溶劑)腹腔注射，每只0.3ml，以上三組均為每周腹腔注射2次(周一和周四)，共60天； 2．模型的制作：鈍性分離單純?nèi)毖M和缺血治療組大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用0號(hào)手術(shù)線分別結(jié)扎其近心端及遠(yuǎn)心端，并從中間剪斷；分離假手術(shù)組雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，也不剪斷。間隔1周后，單純?nèi)毖M和缺血治療組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，假手術(shù)組大鼠行類似分離操

6、作，但不切除卵巢，術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)； 3．標(biāo)本的制作：手術(shù)后60天，通過(guò)Y-迷宮試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試，然后經(jīng)心臟灌注，用4﹪的多聚甲醛固定后做石蠟切片，供HE染色及免疫組化用； 4．觀察指標(biāo)： (1)認(rèn)知能力：測(cè)試方法采用MG-Y型迷宮箱，訓(xùn)練大鼠按信號(hào)燈跑向安全通道。每次測(cè)試均在上午8：00-11：00進(jìn)行。 (2)HE染色：光鏡下觀察海馬組織的病理變化。 (3)用免疫組化法觀

7、察突觸素、CHAT和nNOS的表達(dá)，并利用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)SYN、CHAT免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定。 5．統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果 (1)一般情況：模型大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈完全阻斷后，首先出現(xiàn)短暫驚厥，翻正反射消失，伴體溫降低，呼吸減慢。術(shù)后5-7天各組爬行基本恢復(fù)，無(wú)

8、明顯運(yùn)動(dòng)障礙； (2)認(rèn)知能力：各組大鼠錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)如下：假手術(shù)組：34.50±7.29；單純?nèi)毖M：81.67±11.02；缺血治療組：60.83±15.90；單純?nèi)毖M、缺血治療組與假手術(shù)組相比，認(rèn)知能力下降，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.01)；缺血治療組與單純?nèi)毖M相比也有明顯差別，缺血治療組較單純?nèi)毖M的錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.01)； (3)HE染色：假手術(shù)組偶有神經(jīng)元細(xì)胞變性、死亡，大部分細(xì)胞形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯的

9、病理變化，單純?nèi)毖M見(jiàn)海馬神經(jīng)元的病理?yè)p害加重，CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次減少，排列稀疏、紊亂，細(xì)胞脫失顯著，細(xì)胞核體積小、深染，固縮為三角形或多角形，神經(jīng)纖維排列紊亂，與單純?nèi)毖M相比，缺血治療組腦組織損害程度明顯減輕； (4)各組大鼠腦海馬組織CHAT的表達(dá)：應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析CHAT陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度值，與假手術(shù)組比較，缺血組和缺血治療組大鼠海馬CA1區(qū)CHAT灰度值均有明顯減少(P<0.01)；與缺血治療組比較，缺血組CHA

10、T的灰度值下降更為明顯(P<0.01)； (5)各組大鼠腦海馬組織突觸素的表達(dá)：應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析突觸素陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度值，與假手術(shù)組比較，缺血組和缺血治療組大鼠海馬CA1區(qū)突觸素的灰度值均有明顯減少(P<0.01)；與缺血組相比，治療組突觸素的灰度值明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)： (6)nNOS的免疫組化：缺血組nNOS的陽(yáng)性神經(jīng)元明顯低于其他各組(P<0.01)；缺血治療組腦內(nèi)nNOS的表達(dá)較缺血組