新型生物可降解支架材料的生物學(xué)特性研究和支架法聯(lián)合大網(wǎng)膜修復(fù)膽道損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分聚癸二酸丙二醇聚酯的制備及吻合支架的制造
　　研究目的:制備一種新型生物可降解高分子材料，并以此制造一系列空腔臟器吻合支架。
　　研究方法:將癸二酸、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇以2:3.75:1.25的摩爾比通過(guò)熔融縮聚二步法完成材料制備，經(jīng)無(wú)水甲醇提純。制備的材料采用凝膠滲透色譜(GPC)法測(cè)定其分子量，采用紅外圖譜表征合成產(chǎn)物。根據(jù)吻合支架設(shè)計(jì)模型鑄造相應(yīng)模具，然后通過(guò)注塑的方法制備相應(yīng)的支架。
　　結(jié)

2、果:通過(guò)熔融縮聚的方法成功制備了目標(biāo)產(chǎn)物聚癸二酸丙二醇聚酯(PSPP)，重均分子量為67000左右，數(shù)均分子量為30000左右，分布寬度為2.2。紅外譜圖中分別在1161 cm-1、1728 cm-1、2927 cm-1、2851 cm-1出現(xiàn)吸收峰。以制備的PSPP材料通過(guò)注塑的方法制得各種空腔臟器吻合支架。
　　結(jié)論:以癸二酸、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇為單體，采用熔融縮聚法成功制備了PSPP。通過(guò)注塑法制造了一系列空腔臟

3、器吻合支架。
　　第二部分聚癸二酸丙二醇酯的生物相容性實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的:通過(guò)體外和體內(nèi)生物相容性實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)新型生物可降解聚酯材料PSPP的生物相容性，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:依據(jù)我國(guó)頒布的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)指南(GB/T16886.2008)，選擇細(xì)胞毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)作為體外試驗(yàn)項(xiàng)目，全身毒性試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、植入試驗(yàn)和直腸黏膜刺激試驗(yàn)作為體內(nèi)試驗(yàn)項(xiàng)目來(lái)對(duì)P

4、SPP的生物相容性進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:(1)體外試驗(yàn)：細(xì)胞毒性試驗(yàn)據(jù)24h、48h和72h觀察，PSPP浸提液組的細(xì)胞相對(duì)增殖率RGR值均在75％以上，毒性判定均為1級(jí)；Ames試驗(yàn)在活化或非活化代謝條件下，PSPP組。TA97、TA98、TA100和TA102的菌株回變菌落數(shù)均與陰性對(duì)照組相接近，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)且PSPP組回復(fù)突變菌落數(shù)均未超過(guò)陰性對(duì)照組2倍，判斷為陰性。(2)體內(nèi)試驗(yàn)：皮內(nèi)注射24h、48h、7

5、2h后觀察每只動(dòng)物在每一規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)的原發(fā)性刺激記分均為0；全身毒性反應(yīng)試驗(yàn)分別自尾靜脈注射供試液和空白對(duì)照液4h、24h、48h和72h后，兩組動(dòng)物未出現(xiàn)死亡，進(jìn)食正常，無(wú)嘔吐、呆滯、運(yùn)動(dòng)機(jī)能減退、呼吸困難等癥狀出現(xiàn)；遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)PSPP加和不加弗氏完全佐劑情況下，在致敏后第3天和第7天及激發(fā)后24h和48h，皮膚過(guò)敏反應(yīng)評(píng)分均為0分；直腸黏膜刺激試驗(yàn)連續(xù)直腸灌注1周后通過(guò)肉眼觀察，結(jié)合組織病理學(xué)檢查，未見(jiàn)直腸給藥部位出現(xiàn)充

6、血、紅腫及壞死現(xiàn)象；植入試驗(yàn)大體標(biāo)本觀察，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組2w時(shí)可見(jiàn)周?chē)M織輕度水腫，4w、12w均可見(jiàn)材料被一薄層囊壁包繞，與周?chē)M織無(wú)明顯粘連，未發(fā)現(xiàn)周?chē)M織有充血、水腫、壞死等異常情況，組織學(xué)觀察2w時(shí)兩組炎癥細(xì)胞反應(yīng)均為Ⅳ級(jí)，囊腔反應(yīng)均為Ⅳ級(jí)，4w時(shí)炎癥細(xì)胞反應(yīng)均為Ⅲ級(jí)，囊腔反應(yīng)均為Ⅱ級(jí)，12w時(shí)炎癥細(xì)胞反應(yīng)均為Ⅰ級(jí)，囊腔反應(yīng)均為Ⅰ級(jí)。
　　結(jié)論:PSPP無(wú)論在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的生物相容性。
　　第三部分聚癸

7、二酸丙二醇酯的生物降解性能研究
　　研究目的:研究聚癸二酸丙二醇酯(PSPP)在體外和動(dòng)物體內(nèi)不同介質(zhì)中的降解規(guī)律，明確影響PSPP降解速度的主要因素，了解PSPP在消化道不同部位的降解時(shí)間。
　　研究方法:體外降解選擇人新鮮膽汁、模擬胃液和模擬腸液為降解介質(zhì)，PSPP支架為樣本，每種介質(zhì)各設(shè)立48個(gè)樣本。每個(gè)支架獨(dú)立浸泡于裝有10ml降解介質(zhì)的平底試管內(nèi)，37℃，100轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)振蕩，每日更換浸提介質(zhì)。每周每種介質(zhì)分別取

8、出3個(gè)樣本用來(lái)觀察外觀和完整性，檢測(cè)重量和重均分子量，掃描電鏡下觀察表面形態(tài)改變，觀察期為4個(gè)月或至支架崩解.體內(nèi)降解以巴馬小型豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇小腸、胃、結(jié)腸三個(gè)部位進(jìn)行試驗(yàn)，樣品5個(gè)為1串，分別懸掛在相應(yīng)的消化道內(nèi)。小腸每4天處死一頭動(dòng)物，共4頭，胃和結(jié)腸每周處死1頭，各6頭。取出樣本后分別觀察形態(tài)變化，分子量變化，掃描電鏡觀察表面形態(tài)改變。
　　結(jié)果:在體外人新鮮膽汁中，PSPP支架的降解周期約為3.5個(gè)月，觀察期內(nèi)總失重將

9、近60％，重均分子量從原來(lái)的67000左右降低到31000左右，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)支架表面逐漸呈魚(yú)鱗樣改變伴脫落；在模擬胃液中，4個(gè)月內(nèi)支架外形保持完整，支架的重量，重均分子量及支架表面形態(tài)改變均不明顯；在模擬腸液中降解周期約為2.5個(gè)月，失重46％左右，重均分子量降至30000左右，掃描電鏡下，材料表面呈魚(yú)鱗樣改變。體內(nèi)降解中，空腸內(nèi)的降解周期約為2周，重均分子量變化不明顯，掃描電鏡下材料表面明顯被腐蝕；胃內(nèi)降解6周支架厚度變化不明顯，重均

10、分子量稍有下降，掃描電鏡下材料表面變得粗糙伴少量空洞；結(jié)腸內(nèi)5周左右降解，重均分子量呈逐漸下降趨勢(shì)，掃描電鏡下材料表面被腐蝕。
　　結(jié)論:在體外人新鮮膽汁中，PSPP支架的降解周期約為3.5個(gè)月，在模擬腸液中降解周期約為2.5個(gè)月，在模擬胃液中降解周期在4個(gè)月以上，堿性性環(huán)境有助于PSPP降解，酸性環(huán)境中，PSPP表現(xiàn)為相對(duì)生物惰性，膽汁的乳化功能和胰酶均對(duì)PSPP降解起到明顯促進(jìn)作用。在體內(nèi)，PSPP支架在空腸內(nèi)降解速度快，時(shí)間

11、約為2周，和小腸吻合口愈合時(shí)間相匹配；結(jié)腸內(nèi)約為5周左右；胃內(nèi)降解速度慢，表現(xiàn)相對(duì)惰性。
　　第四部分內(nèi)支架聯(lián)合大網(wǎng)膜修復(fù)膽道熱損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的:通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)支架聯(lián)合大網(wǎng)膜修復(fù)膽道熱灼傷伴穿孔的可行性和安全性。
　　研究方法:以巴馬小型豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為兩組，每組16頭。手術(shù)構(gòu)建膽總管側(cè)壁熱灼傷伴穿孔的模型，實(shí)驗(yàn)組采用內(nèi)支架聯(lián)合大網(wǎng)膜修補(bǔ)膽管：修剪灼傷膽管后將PSPP支架與膽管兩端荷包捆綁連接

12、，缺損部分由大網(wǎng)膜覆蓋；對(duì)照組采用膽管間斷縫合。術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黃疸和膽漏情況；各組分別于術(shù)后2周、1月、3月和6月處死4頭動(dòng)物并取材，觀察兩組的吻合口愈合情況，比較大體觀、膽道造影情況及組織病理形態(tài)學(xué)改變，包括HE染色和Masson染色，采用免疫組化和定量PCR法測(cè)定吻合口a-SMA、TGF-β1和b-FGF的相對(duì)含量。
　　結(jié)果:兩實(shí)驗(yàn)組均順利完成手術(shù)，術(shù)后無(wú)黃疸及膽漏發(fā)生。將兩組術(shù)后肝功能和膽紅素的變化值進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)

13、照組術(shù)后2周和1月時(shí)ALP變化明顯大于實(shí)驗(yàn)組，術(shù)后3月AST升高明顯高于實(shí)驗(yàn)組，術(shù)后6月DBiL變化明顯高于實(shí)驗(yàn)組。膽道造影顯示實(shí)驗(yàn)組膽管無(wú)明顯狹窄，對(duì)照組術(shù)后3月有一頭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吻合口線(xiàn)樣狹窄伴膽總管擴(kuò)張，對(duì)照組術(shù)后6月有2頭動(dòng)物見(jiàn)近端膽管和肝內(nèi)膽管擴(kuò)張，吻合口可觸及疤痕狹窄。HE染色和Masson染色均顯示術(shù)后各時(shí)段實(shí)驗(yàn)組的吻合口炎癥和纖維增生情況較對(duì)照組輕。免疫組化顯示術(shù)后各時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組的a-SMA和TGF-β1評(píng)分低于對(duì)照組，b-

14、FGF評(píng)分高于對(duì)照組。熒光定量PCR結(jié)果顯示術(shù)后2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF、TGF-β1 mRNA表達(dá)略增加，α-SMAmRNA表達(dá)明顯減少；術(shù)后1月時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF mRNA表達(dá)增加，TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)明顯減少；術(shù)后3月時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF、a-SMAmRNA表達(dá)略減少，TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯減少；術(shù)后6月時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF和a-SMA mRNA表達(dá)相似，TGF-β1mRNA減少