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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
臨床上,面對(duì)因各種原因所致骨缺損、尤其是大塊骨缺損,一直以來(lái)沒(méi)有很理想的修復(fù)材料可供選擇,而當(dāng)前因車禍、腫瘤所導(dǎo)致的骨缺損發(fā)生率卻呈上升趨勢(shì)。骨缺損修復(fù)目前常用的支架材料主要有自體骨、同種異體骨、骨水泥、陶瓷及一些相關(guān)的衍生材料等,這些支架材料均存在不同程度的缺點(diǎn)。組織工程骨的興起為骨缺損修復(fù)支架材料指明了新的發(fā)展方向,組織工程自1987年正式提出和確定后,在種子細(xì)胞、支架材料和組織構(gòu)建技術(shù)等方面取得了明顯進(jìn)展
2、,但是仍有一些問(wèn)題尚待解決和完善,組織工程骨的血管化就是其中之一。
骨缺損植入修復(fù)材料后血管新生需要一個(gè)較長(zhǎng)的過(guò)程,早期的氧和營(yíng)養(yǎng)僅能靠受體的組織液滲透供應(yīng),并且植入的材料由于機(jī)體的凝血反應(yīng)會(huì)被凝血塊包裹,從而使?jié)B透更加困難,因此其大小嚴(yán)重受到局限,這顯然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng)用的要求。促進(jìn)組織工程骨血管化的方法常見(jiàn)的有:用膠原、促血管生成的生長(zhǎng)因子等修飾支架材料;或?qū)⒊晒欠N子細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、成血管前體細(xì)胞共培養(yǎng)等,但是效
3、果欠佳??紤]到移植的組織工程骨主要靠外周血管芽生的方式血管化,一些研究小組利用外周血管芽生的策略,提出了組織工程骨支架材料的預(yù)血管化技術(shù):將材料和細(xì)胞復(fù)合物包埋于皮下、大網(wǎng)膜、筋膜或肌袋中待組織血管化,然后將血管化的組織移植到受區(qū),或者將構(gòu)建的組織工程骨內(nèi)植入動(dòng)靜脈也能明顯促進(jìn)材料細(xì)胞復(fù)合物的血管化及成骨能力,但過(guò)程比較復(fù)雜,并且即便采用了這些方法,組織工程骨植入受區(qū)后,尤其是早期的血液供應(yīng)仍然靠滲透進(jìn)行,沒(méi)有完全解決血管化的難題。
4、r> 本課題組前期所研發(fā)的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)(Acellular bone matrix,ACBM)支架材料較好地保留了細(xì)胞外骨基質(zhì)的主要成分和完整結(jié)構(gòu),并且采用層層自組裝技術(shù),將肝素、殼聚糖復(fù)合在其表面,實(shí)驗(yàn)證明緩釋、抗凝效果可靠;然后在此基礎(chǔ)上聯(lián)合封閉負(fù)壓吸引技術(shù)(Vacuum Assisted closure,VAC),使血液在早期即可在支架材料內(nèi)部實(shí)現(xiàn)持續(xù)“灌注”,為構(gòu)建的組織工程骨即時(shí)、持續(xù)提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。以兔和豬骨缺損
5、為模型的修復(fù)研究結(jié)果證實(shí),HC/ACBM(Heparin-Chotison coated ACBM)材料結(jié)合封閉負(fù)壓技術(shù)使骨缺損修復(fù)支架材料植入后即刻可以獲得血液灌注,與非負(fù)壓側(cè)比較,血容量、血流量及新生血管數(shù)等均顯著增多,并且能促進(jìn)新骨形成。
但是,兔和豬和人差別較大,對(duì)于這種異種來(lái)源的支架材料應(yīng)用于人還有待進(jìn)一步研究。而恒河猴的解剖結(jié)構(gòu)、生理學(xué)等方面與人高度相似,是一種較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,為進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性和有效性,
6、本實(shí)驗(yàn)首先按照ISO10993的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)了這種新材料的安全性和組織相容性的系列指標(biāo),并且在體外研究了模擬負(fù)壓吸引灌注條件下培養(yǎng)對(duì)種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合的影響,建立了恒河猴脛骨缺損的動(dòng)物模型,初步探討了HC/ACBM支架材料聯(lián)合負(fù)壓吸引對(duì)骨缺損修復(fù)過(guò)程中血流灌注和成骨的影響,為下一步的臨床研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
材料與方法:
1.HC/ACBM的生物安全性試驗(yàn)
將本課題組研制的HC/ACBM材料
7、按照ISO10993的標(biāo)準(zhǔn),制作了20%的HC/ACBM的浸提液進(jìn)行了急性、亞急性毒理試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、皮膚刺激性試驗(yàn),以及HC/ACBM的肌肉埋植試驗(yàn)。
對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(mensenchymal stem cell,MSC)進(jìn)行分離、培養(yǎng),然后將HC/ACBM與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),對(duì)表面改良后的材料與MSC的粘附性進(jìn)行了研究。
2.負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞與材料復(fù)合的影響
制作了體外模
8、擬負(fù)壓吸引進(jìn)行細(xì)胞與材料共培養(yǎng)的灌注裝置,以自制的這種裝置將MSC和HC/ACBM共培養(yǎng),對(duì)比研究了負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)MSC的粘附、分布、生存、增殖等方面的影響。
3.HC/ACBM結(jié)合負(fù)壓吸引修復(fù)恒河猴脛骨缺損
建立恒河猴脛骨缺損的模型,以雙側(cè)自體作為對(duì)照,分別觀察了ACBM支架材料抗凝與不抗凝的比較,以及HC/ACBM聯(lián)合負(fù)壓吸引與不聯(lián)合負(fù)壓吸引的比較。利用CT及CT灌注觀察了支架材料在修復(fù)后不
9、同時(shí)間點(diǎn)的血流灌注和成骨情況。
主要結(jié)果和結(jié)論:
1.掃描電鏡顯示的超微結(jié)構(gòu)表明,表面改良后的HC/ACBM仍保留了天然骨的多孔三維結(jié)構(gòu),并且HC/ACBM與MSC仍能緊密的粘附,證實(shí)HC/ACBM具有很好的粘附性。
2.各項(xiàng)安全性檢測(cè)均證實(shí)HC/ACBM無(wú)明顯的毒性,具有良好的安全性和組織相容性。
3.負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)組與靜態(tài)培養(yǎng)組的比較研究表明,負(fù)壓吸引灌注培養(yǎng)條件下,細(xì)胞在材
10、料表面和中心分布的更加均勻,TUNEL法檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)粘附在材料上的細(xì)胞有明顯的凋亡發(fā)生,Brdu法檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞與材料共培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞可以正常進(jìn)行增殖。
4.CT灌注成像顯示,HC/ACBM時(shí)間密度曲線呈血液灌注的表現(xiàn),而ACBM材料呈血液滲透曲線。血容量、血流量圖象顯示體內(nèi)植入HC/ACBM這種抗凝材料修復(fù)骨缺損,不僅材料周邊部分有血液灌注,材料中心出現(xiàn)血液的時(shí)間也明顯早于非抗凝材料;
5.利用填充床式生物反
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