亞慢性砷暴露對(duì)小腦的神經(jīng)毒作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　砷(Arsenic，As)是一種類金屬，以無機(jī)砷和有機(jī)砷兩種形態(tài)在自然界廣泛分布。慢性砷中毒已成為影響數(shù)百萬人健康的世界性公共衛(wèi)生問題。在砷污染地區(qū)，飲用水或地下水中砷濃度達(dá)到0.25～2.1 ppm，污染嚴(yán)重的地方砷濃度已超過3.0 ppm。孟加拉國、印度和中國是全世界受危害人口最多、病區(qū)面積最大、病情最嚴(yán)重的國家。我國飲水型砷中毒病區(qū)高砷暴露人群接近300萬，且不包括由于燃煤引起的燃煤型地方性砷中毒。
　　砷

2、暴露對(duì)健康的危害是多方面的，慢性砷中毒可致引發(fā)多器官的組織學(xué)與功能上的異常改變，包括呼吸道、消化道、肝臟、腎臟、皮膚組織、免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)細(xì)胞具有不能再生的特點(diǎn)，與其他組織比較神經(jīng)細(xì)胞對(duì)毒物的毒性作用更為敏感，因此砷暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性倍受關(guān)注。一些研究報(bào)道，急慢性砷暴露兒童會(huì)出現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)后遺癥。由于腦功能受到抑制，從而導(dǎo)致神經(jīng)組織發(fā)育障礙和智力低下，例如出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、心理、感覺和語言等功能障礙。對(duì)孟加拉國砷含量偏

3、高地區(qū)進(jìn)行的兩項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童水砷暴露與智力降低密切相關(guān)，與染砷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。提示，砷中毒影響青少年學(xué)習(xí)記憶能力。然而，砷暴露影響學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)理目前尚不十分清楚。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，砷暴露可導(dǎo)致小鼠小腦中砷含量呈劑量依賴性增高，且損傷小腦神經(jīng)元，影響小腦功能。這些結(jié)果提示，小腦可能是砷毒性作用的靶器官之一。研究顯示:小腦不僅負(fù)責(zé)調(diào)解肌張力、保持身體平衡和協(xié)調(diào)精細(xì)運(yùn)動(dòng)，而且參與認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)，包括學(xué)習(xí)能力、注意集中力、語言能

4、力等。上述動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道表明，損傷性影響小腦功能可能與砷暴露導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降有關(guān)。有研究報(bào)道鉛、鋁、氟等暴露可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。而且已證實(shí)鉛、鋁、氟的神經(jīng)毒性與調(diào)控學(xué)習(xí)記憶機(jī)制相關(guān)蛋白的編碼基因表達(dá)變化有關(guān)。近年來，越來越多的學(xué)者開始把小腦作為神經(jīng)毒物靶器官開展研究。那么，砷的神經(jīng)毒作用機(jī)制是否與小腦學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因表達(dá)紊亂有關(guān)呢，引起我們極大興趣。
　　基因芯片技術(shù)因具有快速、準(zhǔn)確、同時(shí)分析大量基因信息的特點(diǎn)

5、，被廣泛運(yùn)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。采用基因芯片技術(shù)研究在環(huán)境毒物刺激條件下的大量基因差異表達(dá)情況，可揭示神經(jīng)毒性相關(guān)的分子生物機(jī)制。運(yùn)用基因芯片技術(shù)分析砷暴露所致小腦基因表達(dá)譜變化，對(duì)篩選砷所致神經(jīng)毒性相關(guān)基因及其探討可能機(jī)制有著重要的作用。
　　本研究采用成年小鼠進(jìn)行飲水砷染毒，并觀察亞慢性砷暴露對(duì)小鼠小腦學(xué)習(xí)記憶能力的影響;采用基因芯片技術(shù)篩選出砷暴露組與對(duì)照組小鼠小腦的差異表達(dá)基因，經(jīng)通路分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程記憶等相關(guān)通路受到影響;在篩

6、選出的差異表達(dá)基因中，發(fā)現(xiàn)突觸后致密體功能基因表達(dá)受到影響，包括離子型/膜型谷氨酸受體、IP3受體、激酶CaMKⅡ、PLCβ4等;由于這些基因在長(zhǎng)時(shí)程記憶相關(guān)通路中起到關(guān)鍵的作用，引起我們極大興趣，我們觀察了小腦突觸后致密體超微結(jié)構(gòu)，且對(duì)這些基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。并檢測(cè)突觸后致密體關(guān)鍵酶CaMKⅡ的蛋白表達(dá)水平，且對(duì)CaMKⅡ下游長(zhǎng)時(shí)程記憶相關(guān)通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè)。為闡明砷致小腦學(xué)習(xí)記憶功能損害的分子機(jī)制以及防治砷中毒提供依據(jù)。

7、　　方法：
　　1、選用月齡為一個(gè)月的健康昆明小鼠64只，體重22.3～26.4 g，在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。對(duì)照組小鼠飲用滅菌自來水，實(shí)驗(yàn)組小鼠分別飲用1 ppm、2 ppm和4 ppm三氧化二砷水溶液。小鼠飲用水每?jī)商旄鼡Q一次，染毒時(shí)間為2個(gè)月。
　　2、測(cè)定腦砷含量:采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)量方法。
　　3、HE染色觀察小腦組織形態(tài)學(xué)變化。
　　4、檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和小腦運(yùn)動(dòng)性學(xué)習(xí)記憶能力

8、:分別采用Moms水迷宮定向航行試驗(yàn)和瞬膜條件反射試驗(yàn)。
　　5、小鼠小腦組織基因芯片檢測(cè)，差異表達(dá)基因分析。
　　6、檢測(cè)亞慢性砷暴露對(duì)小鼠小腦突觸后致密體基因表達(dá)影響。采用realtime-PCR(RT-PCR)檢測(cè)小腦NMDA受體亞基NR1、AMPA受體亞基GluR1和GluR2、mGlu受體亞基mGluR1、IP3受體亞基IP3R1、激酶CaMKⅡ、PLCβ4基因表達(dá)。
　　7、透射電鏡觀察小鼠小腦組織突觸形態(tài)

9、結(jié)構(gòu)的變化。
　　8、檢測(cè)小腦CaMKⅡ及下游通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)變化。采用免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)小鼠小腦PSD中CaMKⅡ蛋白表達(dá)和磷酸化水平;檢測(cè)小鼠小腦組織Ras、Raf、 ERK1/2的磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠一般情況良好。隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠體重增加。從第36天開始，4 ppm劑量組小鼠體重增幅減慢，與對(duì)照組和1 ppm染砷組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P＜0.05)。這種

10、差異一直維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在染毒末期，2 ppm劑量組小鼠體重增幅減慢，與對(duì)照組和1 ppm染砷組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、各實(shí)驗(yàn)組小鼠小腦砷含量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)且呈劑量依賴關(guān)系。
　　3、本研究高劑量染砷組中，小腦分子細(xì)胞層胞漿染色不均勻，纖維分布不均，細(xì)胞漿淡染，細(xì)胞皺縮。浦肯野細(xì)胞層，小腦組織浦肯野細(xì)胞層胞漿染色淡，纖維（粉染區(qū)）變大，且不均勻，細(xì)胞胞漿淡染，胞核

11、皺縮;顆粒細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量減少。
　　4、亞慢性砷暴露對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)性學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　Morris水迷宮結(jié)果:對(duì)小鼠采用As2O3染毒60天后，與對(duì)照組比較:2 ppm和4 ppm As2O3染毒組小鼠的逃避潛伏期顯著增長(zhǎng)(P＜0.05)，并且逃避潛伏期隨著染毒劑量的增加而增長(zhǎng)。
　　瞬膜條件反射結(jié)果提示:As2O3染毒60天后，4 ppm As2O3染毒小鼠的瞬膜條件反射與對(duì)照組比較呈顯著降低(P＜0.05)。

12、r>　　5、基因芯片結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠小腦基因表達(dá)譜比較，4 ppm染砷組顯示1597個(gè)差異表達(dá)基因，其中1046個(gè)表達(dá)下調(diào)，551個(gè)表達(dá)上調(diào)。GO分析提示，突觸后致密體上蛋白編碼基因的表達(dá)有顯著性差異，KEGG通路分析LTP和LTD為有顯著性差異（且P值最小）的通路。位于突觸后致密體并參與LTP/LTD的基因?yàn)?CaMKⅡ、Gria1、Gria2、Grin1、Itpr1、Grm1、PLCβ4基因。
　　6、與基因芯片結(jié)果一致

13、，CaMKⅡ、Gria1、Gria2、Grin1、Itpr1、Grm1、PLCβ4的mRNA表達(dá)下降。
　　7、透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，As2O3染毒60天后，2 ppm和4 ppm As2O3染毒小鼠的突觸后致密體厚度與對(duì)照組比較顯著變薄(P＜0.05)。
　　8、亞慢性砷暴露后，小鼠小腦CaMKⅡ蛋白表達(dá)及磷酸化狀態(tài)蛋白表達(dá)都下降(P＜0.05)，磷酸化Raf、ERK1/2蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：

14、>　　1、亞慢性砷暴露后，砷在小鼠腦組織中蓄積，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　2、亞慢性砷暴露導(dǎo)致小腦組織形態(tài)學(xué)異常改變，亞慢性砷暴露損害學(xué)習(xí)記憶功能。
　　3、亞慢性砷暴露干擾小腦學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)基因表達(dá)。
　　4、亞慢性砷暴露使小鼠小腦PSD功能基因NR1、Gria1、Gria2、mGluR1、Itpr1、PLCβ4、CaMKⅡ表達(dá)顯著異常;導(dǎo)致小腦組織PSD厚度改變。
　　5、亞慢性砷暴露抑制小鼠小腦CaMKⅡ及其