復(fù)色1號(hào)方水提取物的作用機(jī)制及其外用制劑的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.探討復(fù)色1號(hào)方治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制。
　　2.進(jìn)行復(fù)色1號(hào)方酊劑及凝膠劑的制備。
　　3.考察復(fù)色1號(hào)方酊劑及凝膠劑的質(zhì)量及經(jīng)皮膚用藥的安全性。
　　4.初步探查復(fù)色1號(hào)酊劑及凝膠的臨床療效。
　　方法:
　　1.采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）測(cè)定0.001g/l、0.005g/l、0.01g/l、0.05g/l及0.1g/l1五種不同濃度的復(fù)色1號(hào)方水提取物培養(yǎng)的小鼠B16黑素

2、瘤細(xì)胞吸光度值（A值），設(shè)單純培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以觀察復(fù)色1號(hào)方水提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖的影響;根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取藥物濃度，采用多巴速率氧化法測(cè)定0.001g/l、0.005g/l、0.01g/l三種不同濃度復(fù)色1號(hào)方水提取物在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響，設(shè)單純培養(yǎng)基作為對(duì)照組，在酶標(biāo)儀下測(cè)得各組A值。
　　2.以75％酊劑作為溶劑浸泡復(fù)色1號(hào)方，制成酊劑;以復(fù)色1號(hào)方水提取物為藥

3、物，卡波姆940為主要基質(zhì)，PEG-4000及甘油作為吸濕劑及增稠劑，三乙醇胺為卡波姆的中和劑，月桂氮卓酮作為透皮劑，凱松作為防腐劑，按凝膠劑的制法制成凝膠劑。采用肉眼觀察及離心的方法評(píng)價(jià)酊劑的外觀、澄清度，采用室溫儲(chǔ)存方法觀察酊劑的穩(wěn)定性;采用自身涂布、肉眼觀察及顯微鏡下觀察的方法評(píng)價(jià)凝膠劑的外觀及細(xì)膩度;采用恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、離心及室溫貯存的方法考察凝膠的穩(wěn)定性;用pH計(jì)測(cè)定復(fù)色1號(hào)方酊劑及凝膠劑的pH值。
　　3.選擇FMM

4、U豚鼠4只，Wistar大鼠40只。
　?、倨つw刺激試驗(yàn):豚鼠4只，背部剃毛后按拉丁方設(shè)計(jì)方法，將豚鼠背部皮膚分為四個(gè)區(qū)域，每區(qū)2.0×2.0cm2大小，將酊劑組、凝膠組、酊劑對(duì)照（75％乙醇及0.16％月桂氮卓酮）和凝膠對(duì)照按設(shè)計(jì)方法涂在相應(yīng)的皮膚上，酊劑以滲濕一層紗布為宜，凝膠涂0.lg/區(qū)為度，仔細(xì)、緩慢涂布，不得使藥物流失。用一層保鮮膜覆蓋保濕，再加紗布覆蓋保護(hù)，最后用無(wú)刺激性膠布和繃帶適當(dāng)固定，以防止敷料脫落。每天受試藥

5、與對(duì)照物同時(shí)涂布1次，連續(xù)14天，每次涂抹后6小時(shí)，用溫水洗去殘留涂抹物。在每次去除涂抹物后1小時(shí)及再次涂抹前觀察并記錄涂抹部位紅斑水腫情況及是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況，其發(fā)生及消退時(shí)間，并對(duì)紅斑水腫進(jìn)行評(píng)分，末次給藥后去除受試物后1、24、48及72小時(shí)觀察涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等情況。
　　②皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn):大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，第1組為復(fù)色酊劑組，第2組為凝膠組，第3組為陽(yáng)性對(duì)照組（2，

6、4一二硝基氯代苯），第4組為酊劑空白對(duì)照組（酊劑基質(zhì)），第5組為凝膠空白對(duì)照組（凝膠的賦形劑）。每只大鼠每次涂藥量為0.1g（酊劑以滲透1層紗布為度），致敏給藥于大鼠的左側(cè)皮膚進(jìn)行，激發(fā)給藥于大鼠的右側(cè)皮膚進(jìn)行。致敏給藥:將受試物涂在各組大鼠左側(cè)脫毛區(qū)，持續(xù)6小時(shí)后用溫水擦去受試物，第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次。陽(yáng)性對(duì)照組用1％2，4—二硝基氯代苯溶液。激發(fā)給藥:于末次給受試物致敏后14天，將受試物及對(duì)照物涂布于大鼠背部右側(cè)脫毛區(qū)

7、。陽(yáng)性對(duì)照組用0.1％2，4—二硝基氯代苯溶液。6小時(shí)后溫水擦去受試物，即刻觀察，并于24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)重復(fù)觀察涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等過(guò)敏反應(yīng)，并按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)紅斑和水腫進(jìn)行評(píng)分。
　　4.觀察臨床上以復(fù)色1號(hào)酊劑及凝膠劑治療的45例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者的皮損，進(jìn)一步考察此2種外用劑型經(jīng)皮膚用藥的刺激性及致敏性。節(jié)選2例典型病例說(shuō)明此兩種劑型聯(lián)合內(nèi)服藥治療白癜風(fēng)的療效和安全性，以肉眼觀察皮損色素恢復(fù)作為療效指標(biāo)。
　　

8、5.統(tǒng)計(jì)方法:以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(i)土S表示，兩組組間顯著性檢驗(yàn)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn);多組組間顯著性檢驗(yàn)用one-way Annova分析或協(xié)方差分析，多因素多水平顯著性檢驗(yàn)用析因分析資料的方差分析，組間多重比較采用bonferroni檢驗(yàn)分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.復(fù)色1號(hào)方水提取物在0.001～0.01g/l濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖

9、與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，0.05～0.1g/l對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖與對(duì)照組相比有顯著意義(P＜0.001)，呈現(xiàn)一定的抑制作用;在0.001g/l～0.1g/l濃度范圍內(nèi)，含藥培養(yǎng)基組的A值（酪氨酸酶活性）與對(duì)照組比較均有顯著性差異(F=2059.17，P＜0.001)，藥物濃度越高，酪氨酸酶活性激活作用越明顯;用藥24、48及72小時(shí)之間A值有顯著性差異(F=351.76，P＜0.001)，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)

10、，小鼠B16黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性逐漸增強(qiáng)。
　　2.制備的酊劑澄清，紫褐色，澄清，有辛香及乙醇?xì)馕?，濃度為相?dāng)于原生藥的18％。制備的凝膠劑為棕褐色半透明膏體，色澤、質(zhì)地均勻，外觀細(xì)膩。酊劑樣品離心后未見(jiàn)明顯沉淀出現(xiàn)，pH計(jì)測(cè)得pH為6.15±0.005。酊劑樣品在室溫下放置1個(gè)月和3個(gè)月后酊劑的包裝無(wú)變化，外觀顏色澄清度均無(wú)明顯變化。1個(gè)月后pH值為6.14±0.009，3月后測(cè)得pH為6.12±0.013。凝膠劑藥物分散均

11、勻，質(zhì)地細(xì)膩，稠度適宜，易于涂布。常溫貯存及耐寒耐熱實(shí)驗(yàn)?zāi)z的外觀、色澤及稠度無(wú)明顯變化、無(wú)分層和變色現(xiàn)象，離心實(shí)驗(yàn)?zāi)z無(wú)變粗、分層和沉淀現(xiàn)象，pH值的平均值為5.96±0.012。放置4℃冰箱、室溫后3個(gè)月再次檢測(cè)pH值的平均值分別為5.94±0.011、5.93±0.013。
　　3.按皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及刺激強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷，復(fù)色1號(hào)方酊劑及凝膠劑對(duì)豚鼠皮膚無(wú)紅斑、水腫和脫屑等刺激反應(yīng);按皮膚變態(tài)反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和致敏率分類

12、來(lái)判斷，復(fù)色l號(hào)方酊劑及凝膠劑對(duì)大鼠皮膚無(wú)紅斑、水腫等過(guò)敏反應(yīng)，也未見(jiàn)哮喘、休克等嚴(yán)重的全身過(guò)敏反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照組2，4—二硝基氯代苯致敏試驗(yàn)和激發(fā)試驗(yàn)期間所有大鼠均出現(xiàn)紅斑和水腫，大鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)積分均為＞1，致敏率為100％。
　　4.臨床上以復(fù)色1號(hào)酊劑及凝膠劑治療的45例白癜風(fēng)患者均未出現(xiàn)皮膚刺激及過(guò)敏反應(yīng)。節(jié)選的2例白癜風(fēng)患者均取得滿意療效，治療過(guò)程中未出現(xiàn)紅斑、水腫、水皰、苔蘚樣變及皮膚瘙癢等不良反應(yīng)。
　　結(jié)論:

13、
　　1.復(fù)色1號(hào)方水提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性有明顯的激活作用。通過(guò)促進(jìn)酪氨酸酶活性以促進(jìn)黑素合成，是復(fù)色1號(hào)方治療白癜風(fēng)的一個(gè)作用機(jī)制。復(fù)色1號(hào)方對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖無(wú)促進(jìn)作用，且在高濃度對(duì)黑素瘤細(xì)胞的增殖呈抑制作用，表明促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖可能不是本方治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制。
　　2.按傳統(tǒng)方法制成的復(fù)色1號(hào)方酊劑澄清。按我們研究設(shè)計(jì)出來(lái)的配方制備的復(fù)色1號(hào)方凝膠劑外觀好看，質(zhì)地細(xì)膩，稠度適宜，易于涂

14、布。穩(wěn)定性考察試驗(yàn)顯示，酊劑與凝膠劑性狀較穩(wěn)定。酊劑pH值為6.15±0.005。室溫下放置1月后pH值為6.14±0.009，3月后pH值6.12±0.013。凝膠的pH值為5.96±0.012，放置4℃冰箱、室溫后3個(gè)月pH值的平均值分別為5.94±0.011、5.93±0.013。2種劑型均符合《中國(guó)藥典》酊劑及凝膠劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定。
　　3.豚鼠的皮膚刺激試驗(yàn)及皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)色1號(hào)酊劑及凝膠劑對(duì)豚鼠皮膚無(wú)