復(fù)色1號方水提取物的作用機制及其外用制劑的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.探討復(fù)色1號方治療白癜風(fēng)的作用機制。
　　2.進(jìn)行復(fù)色1號方酊劑及凝膠劑的制備。
　　3.考察復(fù)色1號方酊劑及凝膠劑的質(zhì)量及經(jīng)皮膚用藥的安全性。
　　4.初步探查復(fù)色1號酊劑及凝膠的臨床療效。
　　方法:
　　1.采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）測定0.001g/l、0.005g/l、0.01g/l、0.05g/l及0.1g/l1五種不同濃度的復(fù)色1號方水提取物培養(yǎng)的小鼠B16黑素

2、瘤細(xì)胞吸光度值（A值），設(shè)單純培養(yǎng)基作為對照組，以觀察復(fù)色1號方水提取物對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖的影響;根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選取藥物濃度，采用多巴速率氧化法測定0.001g/l、0.005g/l、0.01g/l三種不同濃度復(fù)色1號方水提取物在培養(yǎng)24小時、48小時及72小時后對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響，設(shè)單純培養(yǎng)基作為對照組，在酶標(biāo)儀下測得各組A值。
　　2.以75％酊劑作為溶劑浸泡復(fù)色1號方，制成酊劑;以復(fù)色1號方水提取物為藥

3、物，卡波姆940為主要基質(zhì)，PEG-4000及甘油作為吸濕劑及增稠劑，三乙醇胺為卡波姆的中和劑，月桂氮卓酮作為透皮劑，凱松作為防腐劑，按凝膠劑的制法制成凝膠劑。采用肉眼觀察及離心的方法評價酊劑的外觀、澄清度，采用室溫儲存方法觀察酊劑的穩(wěn)定性;采用自身涂布、肉眼觀察及顯微鏡下觀察的方法評價凝膠劑的外觀及細(xì)膩度;采用恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、離心及室溫貯存的方法考察凝膠的穩(wěn)定性;用pH計測定復(fù)色1號方酊劑及凝膠劑的pH值。
　　3.選擇FMM

4、U豚鼠4只，Wistar大鼠40只。
　　①皮膚刺激試驗:豚鼠4只，背部剃毛后按拉丁方設(shè)計方法，將豚鼠背部皮膚分為四個區(qū)域，每區(qū)2.0×2.0cm2大小，將酊劑組、凝膠組、酊劑對照（75％乙醇及0.16％月桂氮卓酮）和凝膠對照按設(shè)計方法涂在相應(yīng)的皮膚上，酊劑以滲濕一層紗布為宜，凝膠涂0.lg/區(qū)為度，仔細(xì)、緩慢涂布，不得使藥物流失。用一層保鮮膜覆蓋保濕，再加紗布覆蓋保護，最后用無刺激性膠布和繃帶適當(dāng)固定，以防止敷料脫落。每天受試藥

5、與對照物同時涂布1次，連續(xù)14天，每次涂抹后6小時，用溫水洗去殘留涂抹物。在每次去除涂抹物后1小時及再次涂抹前觀察并記錄涂抹部位紅斑水腫情況及是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況，其發(fā)生及消退時間，并對紅斑水腫進(jìn)行評分，末次給藥后去除受試物后1、24、48及72小時觀察涂抹部位有無紅斑和水腫等情況。
　　②皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗:大鼠40只，隨機分為5組，每組8只，第1組為復(fù)色酊劑組，第2組為凝膠組，第3組為陽性對照組（2，

6、4一二硝基氯代苯），第4組為酊劑空白對照組（酊劑基質(zhì)），第5組為凝膠空白對照組（凝膠的賦形劑）。每只大鼠每次涂藥量為0.1g（酊劑以滲透1層紗布為度），致敏給藥于大鼠的左側(cè)皮膚進(jìn)行，激發(fā)給藥于大鼠的右側(cè)皮膚進(jìn)行。致敏給藥:將受試物涂在各組大鼠左側(cè)脫毛區(qū)，持續(xù)6小時后用溫水擦去受試物，第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次。陽性對照組用1％2，4—二硝基氯代苯溶液。激發(fā)給藥:于末次給受試物致敏后14天，將受試物及對照物涂布于大鼠背部右側(cè)脫毛區(qū)

7、。陽性對照組用0.1％2，4—二硝基氯代苯溶液。6小時后溫水擦去受試物，即刻觀察，并于24小時、48小時和72小時重復(fù)觀察涂抹部位有無紅斑和水腫等過敏反應(yīng)，并按評分標(biāo)準(zhǔn)對紅斑和水腫進(jìn)行評分。
　　4.觀察臨床上以復(fù)色1號酊劑及凝膠劑治療的45例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者的皮損，進(jìn)一步考察此2種外用劑型經(jīng)皮膚用藥的刺激性及致敏性。節(jié)選2例典型病例說明此兩種劑型聯(lián)合內(nèi)服藥治療白癜風(fēng)的療效和安全性，以肉眼觀察皮損色素恢復(fù)作為療效指標(biāo)。
　　

8、5.統(tǒng)計方法:以SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以(i)土S表示，兩組組間顯著性檢驗用獨立樣本T檢驗;多組組間顯著性檢驗用one-way Annova分析或協(xié)方差分析，多因素多水平顯著性檢驗用析因分析資料的方差分析，組間多重比較采用bonferroni檢驗分析。當(dāng)P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.復(fù)色1號方水提取物在0.001～0.01g/l濃度范圍內(nèi)對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖

9、與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，0.05～0.1g/l對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖與對照組相比有顯著意義(P＜0.001)，呈現(xiàn)一定的抑制作用;在0.001g/l～0.1g/l濃度范圍內(nèi)，含藥培養(yǎng)基組的A值（酪氨酸酶活性）與對照組比較均有顯著性差異(F=2059.17，P＜0.001)，藥物濃度越高，酪氨酸酶活性激活作用越明顯;用藥24、48及72小時之間A值有顯著性差異(F=351.76，P＜0.001)，且隨培養(yǎng)時間的延長

10、，小鼠B16黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶活性逐漸增強。
　　2.制備的酊劑澄清，紫褐色，澄清，有辛香及乙醇?xì)馕叮瑵舛葹橄喈?dāng)于原生藥的18％。制備的凝膠劑為棕褐色半透明膏體，色澤、質(zhì)地均勻，外觀細(xì)膩。酊劑樣品離心后未見明顯沉淀出現(xiàn)，pH計測得pH為6.15±0.005。酊劑樣品在室溫下放置1個月和3個月后酊劑的包裝無變化，外觀顏色澄清度均無明顯變化。1個月后pH值為6.14±0.009，3月后測得pH為6.12±0.013。凝膠劑藥物分散均

11、勻，質(zhì)地細(xì)膩，稠度適宜，易于涂布。常溫貯存及耐寒耐熱實驗?zāi)z的外觀、色澤及稠度無明顯變化、無分層和變色現(xiàn)象，離心實驗?zāi)z無變粗、分層和沉淀現(xiàn)象，pH值的平均值為5.96±0.012。放置4℃冰箱、室溫后3個月再次檢測pH值的平均值分別為5.94±0.011、5.93±0.013。
　　3.按皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)及刺激強度評分標(biāo)準(zhǔn)來判斷，復(fù)色1號方酊劑及凝膠劑對豚鼠皮膚無紅斑、水腫和脫屑等刺激反應(yīng);按皮膚變態(tài)反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)和致敏率分類

12、來判斷，復(fù)色l號方酊劑及凝膠劑對大鼠皮膚無紅斑、水腫等過敏反應(yīng)，也未見哮喘、休克等嚴(yán)重的全身過敏反應(yīng)。陽性對照組2，4—二硝基氯代苯致敏試驗和激發(fā)試驗期間所有大鼠均出現(xiàn)紅斑和水腫，大鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)積分均為＞1，致敏率為100％。
　　4.臨床上以復(fù)色1號酊劑及凝膠劑治療的45例白癜風(fēng)患者均未出現(xiàn)皮膚刺激及過敏反應(yīng)。節(jié)選的2例白癜風(fēng)患者均取得滿意療效，治療過程中未出現(xiàn)紅斑、水腫、水皰、苔蘚樣變及皮膚瘙癢等不良反應(yīng)。
　　結(jié)論:

13、
　　1.復(fù)色1號方水提取物對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性有明顯的激活作用。通過促進(jìn)酪氨酸酶活性以促進(jìn)黑素合成，是復(fù)色1號方治療白癜風(fēng)的一個作用機制。復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖無促進(jìn)作用，且在高濃度對黑素瘤細(xì)胞的增殖呈抑制作用，表明促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖可能不是本方治療白癜風(fēng)的作用機制。
　　2.按傳統(tǒng)方法制成的復(fù)色1號方酊劑澄清。按我們研究設(shè)計出來的配方制備的復(fù)色1號方凝膠劑外觀好看，質(zhì)地細(xì)膩，稠度適宜，易于涂

14、布。穩(wěn)定性考察試驗顯示，酊劑與凝膠劑性狀較穩(wěn)定。酊劑pH值為6.15±0.005。室溫下放置1月后pH值為6.14±0.009，3月后pH值6.12±0.013。凝膠的pH值為5.96±0.012，放置4℃冰箱、室溫后3個月pH值的平均值分別為5.94±0.011、5.93±0.013。2種劑型均符合《中國藥典》酊劑及凝膠劑項下有關(guān)的各項規(guī)定。
　　3.豚鼠的皮膚刺激試驗及皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果顯示，復(fù)色1號酊劑及凝膠劑對豚鼠皮膚無