金黃色葡萄球菌中含絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列的基因的分子研究.pdf

1、很多重要的致病菌可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer)獲得毒力因子和抗生素抗性基因，因此水平基因轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是細(xì)菌基因組進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力之一，而比較基因組學(xué)分析則是鑒定病原菌中水平基因轉(zhuǎn)移的重要工具。絲氨酸-天冬氨酸二肽重復(fù)序列(sdr)基因是細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白，預(yù)計(jì)和細(xì)菌侵染宿主有關(guān)，目前逐漸受到重視。然而相關(guān)報(bào)道還非常少。為了比較不同宿主來(lái)源的金黃色葡萄球菌基因組的序列差異性，在本論文第一部分第一章的研

2、究中，我們比對(duì)分析了21株已公布的全基因組測(cè)序的金黃色葡萄球菌、以及218株加拿大奶牛乳腺炎相關(guān)的金黃色葡萄球菌中的4個(gè)sdr基因。結(jié)果表明奶牛乳腺炎來(lái)源的金黃色葡萄球菌(RF122及本研究中所用菌)，綿羊乳腺炎來(lái)源的菌株(ED133)，豬、牛、人多宿主來(lái)源菌株(ST398)，患有BCO癥的雞來(lái)源的菌株(ED98)，以及來(lái)源于人并具有甲氧西林抗性的菌株(TCH130、MRSA252、Mu3、Mu50、N315、04-02981、JH1、

3、JH9)之間往往含有相同的sdr基因。這提示著sdr基因可以在不同菌株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增強(qiáng)了金黃色葡萄球菌獲得毒力因子的效率。其次，我們?cè)诙鄠€(gè)sdr基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些插入突變和缺失突變，且鑒定獲得一個(gè)新的插入序列，其插入到sdrC基因，可能和sdrC基因在不同菌株之間的水平基因轉(zhuǎn)移有關(guān)。第三，我們利用sdr基因?qū)瘘S色葡萄球菌進(jìn)行了分型，分型結(jié)果可以清晰表現(xiàn)菌株之間的進(jìn)化差異性和關(guān)聯(lián)性，并且該分型方法比常規(guī)的MLST分型方法或者PFG

4、E方法更精確、方便、花費(fèi)少。第四，我們還發(fā)現(xiàn)sdr基因和致病菌或隱性菌有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，比如絕大部分致病菌含有sdrD基因，而隱性菌則很少含有該基因。第五，傳統(tǒng)的針對(duì)細(xì)胞粘附因子、侵染因子、以及毒素等毒力因子的分布研究往往只檢查很短的基因保守區(qū)，而我們本次分布研究檢測(cè)了這些因子的全長(zhǎng)序列或者其全長(zhǎng)功能區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這些毒力因子內(nèi)包含大量的突變，這些突變會(huì)深刻影響該毒力因子的功能。因此僅檢查很短的保守區(qū)的傳統(tǒng)基因分布研究方法是不精確、不可信的，

5、本研究手段對(duì)于基因分布研究也有廣泛的借鑒意義?？傊?，本研究最重要的發(fā)現(xiàn)是證實(shí)金黃色葡萄球菌之間可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移從臨近菌株獲得致病基因。而當(dāng)前人口流動(dòng)加速、畜牧學(xué)迅速發(fā)展可能不經(jīng)意間提高了細(xì)菌病原體之間的接觸機(jī)會(huì)，加快了細(xì)菌病原體的進(jìn)化速度。因此，本章研究對(duì)于細(xì)菌抗藥性研究以及畜牧學(xué)發(fā)展等方面有重大指導(dǎo)意義。
　　原核生物或者真核生物中的串聯(lián)重復(fù)序列(包括微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA)是易突變DNA，而針對(duì)原核生物基因組的小衛(wèi)星D

6、NA的研究非常少。細(xì)菌(尤其是葡萄球菌）細(xì)胞表面的黏附因子通常包含絲氨酸-天冬氨酸二肽(SD)重復(fù)序列，這種SD重復(fù)序列由一種小衛(wèi)星DNA編碼，對(duì)SD重復(fù)序列的功能研究將加深對(duì)原核生物小衛(wèi)星DNA的理解。在第二章研究中，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析首先研究了SD重復(fù)序列在自然界所有已知蛋白中的分布狀況，再利用基于質(zhì)粒的測(cè)試方式檢測(cè)了SD重復(fù)序列的穩(wěn)定性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD重復(fù)序列主要存在于細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白。分析其拷貝數(shù)量變化方式，我們發(fā)現(xiàn)SD重

7、復(fù)序列具有不穩(wěn)定性和多態(tài)性。最重要的是，其拷貝數(shù)量的變化是可逆的，并且整個(gè)變化過(guò)程不會(huì)發(fā)生移碼突變。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的序列重排熱點(diǎn)，ATTC/AGRT位點(diǎn)，該位點(diǎn)和SD重復(fù)序列的不穩(wěn)定性及可逆性有關(guān)。SD重復(fù)序列的這些特征使得細(xì)菌可以低成本、低風(fēng)險(xiǎn)、高效率快速應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化，增加其在惡劣環(huán)境中生存的幾率。因此，我們提出把SD重復(fù)序列作為細(xì)菌應(yīng)急位點(diǎn)，它是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境波動(dòng)的重要方式之一，并且應(yīng)該廣受重視。
　　在第二部分的研

8、究中我們通過(guò)定向進(jìn)化，提高了來(lái)自非培養(yǎng)瘤胃真菌Neocallimastigales的11家族木聚糖酶XynR8的熱穩(wěn)定性。通過(guò)高通量96孔掃描系統(tǒng)，我們對(duì)木聚糖酶突變子庫(kù)進(jìn)行了篩選。75℃熱處理5分鐘后，木聚糖酶XynR8野生型喪失80％酶活，而定向進(jìn)化獲得的三個(gè)突變子表現(xiàn)出了比野生型更高的熱穩(wěn)定性。三個(gè)突變子共含有五個(gè)氨基酸突變，分別為:I38V、A104T、F116L、D137G、G151D。隨后，我們利用DNA改組技術(shù)和定點(diǎn)突變進(jìn)

9、一步鑒定這5個(gè)位點(diǎn)對(duì)于熱穩(wěn)定性提高的具體效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)I38V、D137G、G151D對(duì)于蛋白熱穩(wěn)定性提高是有積極作用的。我們又通過(guò)RosettaDesign軟件進(jìn)行飽和突變預(yù)測(cè)分析，按照分析結(jié)果，38、137、151三個(gè)位點(diǎn)被突變?yōu)槠渌?個(gè)代表性氨基酸，來(lái)篩選每個(gè)位點(diǎn)熱穩(wěn)定性最高的氨基酸?；谠摵Y選結(jié)果，我們通過(guò)DNA改組技術(shù)最終獲得了熱穩(wěn)定性最高的突變子X(jué)ynR8_VNE。該突變子包含3個(gè)突變I38V、D137N、G151E，T