TRPM7調(diào)控肝纖維化大鼠HSC的增殖、膠原合成和降解以及部分機制研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟對各種慢性刺激進行損傷修復反應時,以膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝內(nèi)大量沉積的病理過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纖維化形成過程中居核心地位,激活的HSC是產(chǎn)生ECM的主要來源。
　　瞬時受體電位通道7(transient receptor potential melastatin7,TR

2、PM7)是具有非選擇性陽離子通道和蛋白激酶雙重結(jié)構的雙功能膜蛋白。作為離子通道蛋白,其對包括Ca2+、Mg2+、K+、Na+在內(nèi)的多種二價和單價陽離子具有通透性,而作為一種蛋白激酶,其可使自身或底物磷酸化。TRPM7分布廣泛,組成性表達于哺乳動物的心、肝、腎、肺、腦等多種器官和組織中,通過影響[Ca2+]i的變化及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路,參與細胞的多種生理和病理過程。
　　我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),PDGF-BB(20 ng/ml)刺激大

3、鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)12 h后,TRPM7 mRNA和蛋白水平均顯著提高(P<0.01)。運用非特異性阻斷劑2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)或Gd3+阻斷TRPM7通道,可顯著提高HSC-T6對腫瘤壞死因子凋亡相關配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)敏感性,增加細胞凋亡。

4、提示TRPM7參與HSC凋亡過程,且阻斷TRPM7可促進HSC凋亡。
　　鑒于TRPM7具有促進細胞增殖的功能,以及HSC活化增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要細胞生物學基礎,我們提出疑問,TRPM7是否參與活化HSC的增殖?TRPM7對活化的HSC膠原產(chǎn)生和降解是否有影響?TRPM7在纖維化肝組織中是否有異常表達?因此,本研究首先搜集人肝纖維化標本和采用經(jīng)典的CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型,觀察 TRPM7表達在體內(nèi)是否有變化;然后選

5、用 HSC-T6細胞株,研究 TRPM7對血小板衍生長因子B(platelet derived growth factor B,PDGF-BB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導的HSC活化、增殖以及膠原生成和降解的影響;最后觀察 TRPM7是否影響PI3K/AKT、ERK以及 TGF-β/Smads通路蛋白表達,進一步明確 TRPM7調(diào)控HSC-T6增殖和膠原合成與降解

6、的分子機制。
　　研究內(nèi)容主要包括以下六個部分:
　　1.TRPM7在纖維化肝組織以及活化HSC中表達增加
　　我們首先檢測人肝纖維化以及 CCl4誘導大鼠肝纖維化模型的肝組織中TRPM7的表達。RT-PCR、免疫組化以及Western blot檢測結(jié)果顯示:肝纖維化組TRPM7 mRNA和蛋白水平顯著高于正常組。原位灌流提取大鼠正常和纖維化肝組織中HSC,Real Time PCR結(jié)果顯示:模型組HSC中TRPM7

7、mRNA水平顯著升高。體內(nèi)試驗結(jié)果表明纖維化肝組織和活化HSC中TRPM7表達顯著增加。
　　PDGF-BB和TGF-β1被認為是強促HSC增殖和膠原合成的因子,也是重要的促纖維化因子。因此,體外試驗選用PDGF-BB和TGF-β1分別刺激HSC-T6細胞株,以闡明TRPM7在HSC活化、增殖、膠原合成和降解過程中的作用。PDGF-BB(10 ng/ml)和TGF-β1(5 ng/ml)體外刺激HSC-T6,TRPM7 mRNA和

8、蛋白表達水平呈時間依賴性地顯著增加。與此同時,HSC活化指標α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscleα-actin,α-SMA)和I型膠原α1(collagen type1 alpha1,Col1α1)mRNA和蛋白亦隨PDGF-BB和TGF-β1刺激時間延長而顯著增加。
　　2.阻斷TRPM7通路,抑制PDGF-BB和TGF-β1誘導的HSC的活化
　　運用離子通道抑制劑2-APB或 siRNA阻斷 TRPM7通道,

9、可顯著抑制由PDGF-BB和TGF-β1誘導的α-SMA和Col1α1表達。提示TRPM7通道在HSC活化和膠原合成過程中可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。
　　3.阻斷TRPM7通路,糾正MMP-2/TIMP-2、MMP-13/TIMP-1比例,調(diào)節(jié)TGF-β1刺激的HSC中膠原的降解
　　肝纖維化過程中,ECM合成和降解失衡,從而導致其過度沉積。纖維化肝組織和TGF-β1刺激活化的HSC-T6中,MMP-2和其抑制因子TIMP-

10、1、TIMP-2表達顯著增加。2-APB或 siRNA阻斷 TRPM7通道,顯著提高活化的HSC-T6中MMP-13 mRNA和蛋白水平,降低TIMP-1、TIMP-2的表達,但對MMP-2的表達無顯著影響。表明阻斷TRPM7通道,可提高MMP-2/TIMP-2、MMP-13/TIMP-1比值,糾正MMPs/TIMPs比例,促進ECM降解。
　　4.阻斷TRPM7通路,降低細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、周期蛋白依賴性激酶

11、4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表達,抑制PDGF-BB誘導的HSC增殖
　　不同濃度(3、10、30、100、300μM)2-APB與PDGF-BB(10 ng/ml)共培養(yǎng)HSC-T6,MTT結(jié)果顯示:2-APB可抑制HSC-T6活力,且抑制活性呈濃度依賴性。運用siRNA沉默HSC-T6中TRPM

12、7,MTT結(jié)果顯示:HSC-T6活力顯著下降。提示阻斷TRPM7通道,可顯著抑制活化的HSC活力。進一步研究發(fā)現(xiàn),2-APB或siRNA阻斷TRPM7通道,可顯著降低細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白表達。表明阻斷TRPM7通道,減少Cyclin D1、CDK4和PCNA表達,影響HSC細胞周期,從而抑制細胞增殖。
　　5.TRPM7通過PI3K/AKT、ERK通路調(diào)控PDGF-BB誘導的HSC增殖
　　

13、PI3K/AKT和ERK信號通路在肝纖維化過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。Western blot結(jié)果顯示大鼠纖維化肝組織和PDGF-BB刺激的HSC-T6中,p-AKT和p-ERK蛋白水平顯著增加。2-APB或siRNA阻斷TRPM7通道,可顯著抑制HSC-T6中AKT、P70S6K和ERK的磷酸化水平。表明阻斷TRPM7通道,抑制HSC中PI3K/AKT和ERK通路,從而抑制細胞增殖。
　　6.TRPM7通過TGF-β1/Smad