環(huán)境鎘暴露人群尿液中小分子代謝產(chǎn)物表征差異研究.pdf

1、環(huán)境鎘污染對(duì)機(jī)體健康損害研究一直是近幾十年來(lái)公共衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。資料顯示,鎘為已知的最易在體內(nèi)蓄積的毒物之一,長(zhǎng)期鎘暴露與腎臟損傷、骨骼損害、心血管疾病等存在正相關(guān)關(guān)系,鎘暴露是眾多損害的危險(xiǎn)因素,其導(dǎo)致患者死亡率增加,尤以女性更甚,腎損害是鎘暴露引起的最早期關(guān)鍵效應(yīng)。
　　在鎘的健康損害效應(yīng)研究中,國(guó)際上將尿鎘作為公認(rèn)的內(nèi)暴露指標(biāo)以反映體內(nèi)鎘負(fù)荷水平,尿β2-MG、NAG等效應(yīng)性生物標(biāo)志物作為早期腎損傷監(jiān)測(cè)指標(biāo),被廣泛應(yīng)

2、用,是鎘中毒人群臨床診斷和治療的重要參考依據(jù)。
　　人們對(duì)于鎘的生理代謝過(guò)程仍知之甚少,對(duì)鎘的健康危害的機(jī)理仍有許多未明之處。本研究擬采用代謝組學(xué)法,探索環(huán)境鎘長(zhǎng)期暴露人群尿中顯著變化的小分子代謝產(chǎn)物,從代謝途徑角度尋找環(huán)境鎘暴露對(duì)機(jī)體健康損害的證據(jù),為進(jìn)一步尋找環(huán)境鎘暴露健康損害相關(guān)的生物標(biāo)志物提供線索。
　　研究目的：
　　探索環(huán)境鎘長(zhǎng)期暴露人群尿中顯著變化的小分子代謝產(chǎn)物,為尋找環(huán)境鎘暴露健康損害相關(guān)的生物標(biāo)志物

3、提供線索。
　　研究方法：
　　1.流行病學(xué)調(diào)查
　　1.1調(diào)查對(duì)象
　　根據(jù)歷史資料和研究目的,選擇某環(huán)境高鎘礦區(qū)作為環(huán)境鎘暴露區(qū),選擇無(wú)明確重金屬污染史,與暴露區(qū)經(jīng)濟(jì)水平相當(dāng)、居民生活條件和生活習(xí)慣相似的地區(qū)作為對(duì)照區(qū)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。選擇本地居住時(shí)間15年以上,以居民家中自產(chǎn)大米和蔬菜為主要食物來(lái)源的45-70歲女性為調(diào)查對(duì)象,排除肝腎疾病及慢性代謝性等疾病。
　　1.2樣本的采集、運(yùn)輸及保存
　　

4、大米和蔬菜的采集、運(yùn)輸及保存
　　采集調(diào)查對(duì)象當(dāng)季家中自種自食大米和葉類(lèi)蔬菜各一份,統(tǒng)一編號(hào)并記錄;統(tǒng)一將收集的大米和新鮮蔬菜迅速送至實(shí)驗(yàn)室,分析前儲(chǔ)存于-4℃冷庫(kù)。
　　尿樣的收集、運(yùn)輸及保存
　　收集調(diào)查對(duì)象空腹晨尿貯存于冷藏箱中,迅速送至實(shí)驗(yàn)室,分裝至凍存管用于相關(guān)分析;尿鎘、肌酐、β2-MG和NAG檢測(cè)工作在樣品收集后8 h內(nèi)完成;進(jìn)行HPLC-Q/TOF檢測(cè)的尿樣儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱中。
　　1.3檢

5、測(cè)指標(biāo)及方法
　　外暴露指標(biāo)：
　　以大米和蔬菜鎘含量作為外暴露指標(biāo),采用ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)。
　　內(nèi)暴露指標(biāo)：
　　以尿鎘作為內(nèi)暴露指標(biāo),采用ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)。
　　腎損傷生物標(biāo)志物
　　以尿肌酐、NAG和β2-MG作為鎘暴露相關(guān)的腎損傷生物標(biāo)志物,采用苦味酸法測(cè)定尿中肌酐含量,采用免疫比濁法檢測(cè)尿中β2-MG和NAG的含量。
　　2.尿液代謝組學(xué)分析
　　2.1代謝組學(xué)分析技術(shù)平

6、臺(tái)
　　樣本前處理：
　　尿樣室溫下解凍后渦旋2min,移取100μL加入配置內(nèi)標(biāo)溶液,充分混合后離心10min,移取上清液后再次離心,將二次離心獲得的上清液上機(jī)分析。
　　液相色譜條件：
　　采用C18反相色譜柱,柱溫保持在50℃,一次進(jìn)樣量為5μL;流動(dòng)相A:純水+0.1％甲酸,B:甲醇+0.1%甲酸,流速0.4 mL/min,執(zhí)行梯度洗脫程序。
　　質(zhì)譜條件：
　　電離源:ESI,毛細(xì)管電壓:3

7、500 V,干燥氣溫度:350℃,流速:10.0 L/min-1,霧化壓力:30 psi,質(zhì)荷比(m/z)檢測(cè)范圍:50~1000。
　　2.2代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理平臺(tái)
　　采用SPSS13.0進(jìn)行秩和檢驗(yàn)和ROC曲線繪制等;采用MPP12.1進(jìn)行色譜峰的識(shí)別和前處理;運(yùn)用SIMCA-P13.0進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析,篩選VIP值較大的小分子代謝產(chǎn)物;通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)篩選的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　3.質(zhì)量控制

8、　　現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查人員經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn),嚴(yán)格按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)選擇調(diào)查對(duì)象;尿樣、大米和蔬菜在運(yùn)輸過(guò)程中保持冷鏈;各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均由實(shí)驗(yàn)室相關(guān)專業(yè)人員承擔(dān),測(cè)定前調(diào)試儀器穩(wěn)定性,樣品進(jìn)樣順序隨機(jī),樣品間穿插空白樣和質(zhì)控樣,要求質(zhì)控樣中內(nèi)標(biāo)物豐度及保留時(shí)間RSD小于10%。
　　結(jié)果：
　　1.流行病學(xué)資料
　　1.1人口學(xué)資料
　　根據(jù)研究目的和納入排除標(biāo)準(zhǔn),本研究以60名女性為調(diào)查對(duì)象,暴露組與對(duì)照組各30人,年齡分別為55

9、.3±6.99歲和59.7±7.52歲。
　　1.2調(diào)查對(duì)象外暴露水平
　　分析暴露組和對(duì)照組人群食用自產(chǎn)大米各30份,蔬菜各30份,與對(duì)照組相比,暴露組米鎘和菜鎘含量增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
　　1.3調(diào)查對(duì)象內(nèi)暴露水平
　　對(duì)照組和暴露組人群尿鎘含量中位數(shù)分別為1.95μg/g.Cr和8.33μg/g.Cr,分析發(fā)現(xiàn),暴露組人群尿鎘含量高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。<

10、br>　　1.4調(diào)查對(duì)象腎損傷相關(guān)生物標(biāo)志物水平
　　對(duì)照組與暴露組人群尿肌酐中位數(shù)分別為84.38 mg/dL和85.25 mg/dL,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);對(duì)照組與暴露組人群尿NAG含量中位數(shù)分別為5.50 U/g.Cr和6.18 U/g.Cr,其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);對(duì)照組與暴露組人群尿β2-MG含量中位數(shù)分別為0.04 mg/g.Cr和0.07 mg/g.Cr,其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

11、提示與對(duì)照組人群相比,本研究中環(huán)境鎘暴露組人群未見(jiàn)腎損害。
　　2.代謝組學(xué)分析
　　2.1檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和精密度
　　正離子模式(ESI+)下,QC樣中內(nèi)標(biāo)物豐度值和保留時(shí)間的RSD分別為5.13%和0.06%,負(fù)離子模式(ESI-)下分別為2.00%和0.06%。提示該檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和精密度符合代謝組學(xué)分析要求。
　　2.2模式識(shí)別
　　通過(guò)HPLC-Q/TOF檢測(cè)出兩組人群尿液中有效代謝物共235

12、1個(gè);經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn),與對(duì)照組相比,暴露組人群尿液中有139個(gè)代謝物發(fā)生變化(P<0.05);將這139個(gè)代謝物用于模式識(shí)別分析,建立PCA和OPLS-DA模型,發(fā)現(xiàn)暴露組和對(duì)照組人群尿液呈現(xiàn)不同的代謝輪廓,建立的OPLS-DA模型能夠解釋兩組人群尿液中全部變異的96.7%,模型對(duì)未知樣本的判別準(zhǔn)確率為95.3%,說(shuō)明建立模型效果良好。結(jié)果表明暴露組人群尿液中存在的某些小分子代謝產(chǎn)物,表現(xiàn)出與對(duì)照組不同的特征。
　　2.3鎘暴露引起

13、變化的代謝產(chǎn)物分析
　　采用VIP值、z值等方法篩選了9個(gè)具有顯著性差異的小分子代謝產(chǎn)物,它們?cè)诒┞督M人群尿液中均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),其AUC值為0.658-0.714,表明通過(guò)觀察這些代謝產(chǎn)物的變化能夠較好地將環(huán)境鎘暴露組與對(duì)照組人群區(qū)分開(kāi)來(lái)。它們可望作為環(huán)境鎘暴露相關(guān)的特征性代謝物提供重要線索。這9個(gè)代謝產(chǎn)物主要為核苷類(lèi)化合物、脂類(lèi)化合物和氨基酸類(lèi)化合物等。
　　結(jié)論：
　　1、通過(guò)HPLC-Q/TOF技術(shù)對(duì)環(huán)境鎘暴露人