牦牛胚胎附植過程中細(xì)胞凋亡及其通路的研究.pdf

1、為了闡明：(1)牦牛胚胎的附植模式、相關(guān)細(xì)胞的變化規(guī)律及滋養(yǎng)巨細(xì)胞(TGC)的遷移規(guī)律，(2)牦牛胚胎附植過程中子宮內(nèi)膜細(xì)胞(EC)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TC)的凋亡規(guī)律，(3)增殖因子Ki-67在牦牛胚胎附植過程中的表達(dá)變化特征，(4)凋亡相關(guān)蛋白Fas/FasL、TNFα/TRADD(TNFα相關(guān)的死亡受體)、Bcl-2/Bax、caspase-3和caspase-9在牦牛胚胎附植過程中的表達(dá)特征及其細(xì)胞發(fā)生凋亡的可能通路，本研究選用青海省

2、大通牦牛育種場成年健康母牦牛15頭，分別在配種后的第16、18、20、22和24天屠宰后取子宮樣品進(jìn)行實驗(每組3頭)。運用光鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察了牦牛胚胎附植過程中EC、胎兒TC和黏附結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律；用光鏡、電鏡、原位凋亡細(xì)胞熒光檢測法(DAPI法)和DNA原位末端標(biāo)記(TUNEL法)檢測了胚胎附植過程中牦牛EC和TC凋亡的變化規(guī)律；用免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測了牦牛胚胎附植過程中EC和TC凋亡相關(guān)蛋白Fas/FasL、TNF

3、α/TRADD、Bcl-2/Bax、caspase-3和caspase-9的表達(dá)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)牦牛胚胎附植開始于妊娠的17-18天，此時胎兒滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜上皮發(fā)生了輕微的并置與黏附，滋養(yǎng)層單核或雙核細(xì)胞侵入子宮上皮是附植開始的標(biāo)志。而完成于妊娠的26-28天之前。整個胚胎附植過程一直伴隨滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜或與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生融合的現(xiàn)象。雙核細(xì)胞最早出現(xiàn)在妊娠18天。大量的糖原顆粒分布于上皮細(xì)胞游離端，并向滋養(yǎng)層擴散。滋

4、養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞間以微絨毛鑲嵌為主要連接方式，有時出現(xiàn)橋粒或簡單連接。牦牛妊娠期子宮上皮多核細(xì)胞，至少部分是由滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移或與子宮內(nèi)膜融合而產(chǎn)生；(2)在胚胎附植過程中，各種細(xì)胞均可發(fā)生凋亡。HE染色時凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核濃縮或形成凋亡小體而深染，胞質(zhì)有空泡化現(xiàn)在。DAPI標(biāo)記時凋亡細(xì)胞核發(fā)強烈的藍(lán)色熒光。DNA末端原位標(biāo)記(TUNEL)下凋亡細(xì)胞核散發(fā)強烈綠色熒光，有時可見凋亡小體。在牦牛胚胎附植早期，凋亡細(xì)胞的主要特征為核

5、濃縮，而到附植的后期，凋亡細(xì)胞的特征則主要為大量凋亡小體的形成及胞漿空泡化，并以單核巨細(xì)胞的凋亡為主。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡特征為核質(zhì)濃縮。電鏡下凋亡細(xì)胞的特征主要為核濃縮、細(xì)胞體積變小及大量的凋亡小體形成。牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡率在妊娠16天最低，僅為6.83﹪。在妊娠的18-22天，凋亡率升高，分別為16.17﹪，16.0﹪和13.81﹪。而到妊娠的第24天最高，達(dá)22.82﹪，與妊娠16天的凋亡率差異顯著(P＜0

6、.05)。牦牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡率在附植過程中的變化不大，最高為18.3﹪(第16天)，而最低為13.38﹪(第18天)。從總體趨勢來看，在胚胎附植的過程中，牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡率有增高趨勢。而滋養(yǎng)層細(xì)胞在附植過程中的凋亡率變化不大。在牦牛胚胎附植的不同階段，子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層上均可見Ki-67陽性細(xì)胞。有時陽性細(xì)胞在子宮內(nèi)膜上皮或滋養(yǎng)層中成團(tuán)分布。在子宮腺上皮細(xì)胞中，Ki-67陽性細(xì)胞較少。在牦牛胚胎附植過程中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞

7、中的增殖因子Ki-67陽性細(xì)胞率一直較高。在妊娠16天為42.25﹪，到妊娠18天最高，達(dá)57.75﹪，隨后緩慢下降，到妊娠24天時，僅為26.88﹪。而在滋養(yǎng)層上中的變化規(guī)律與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞一致?；|(zhì)細(xì)胞中也偶爾可見陽性細(xì)胞出現(xiàn)；(3)牦牛胚胎附植過程中，子宮內(nèi)膜上皮和滋養(yǎng)層中Fas/FasL呈陽性表達(dá)，而在子宮內(nèi)膜中的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞也呈Fas/FasL陽性，但在附植過程中的表達(dá)量變化不大。TNF-α和TRADD在牦牛胚胎附植過程

8、中的子宮內(nèi)膜上皮和滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，且具凋亡相的細(xì)胞陽性率較高，表明TNFα和TRADD參與了牦牛胚胎附植過程中子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡過程；Bax蛋白和Bcl-2蛋白在牦牛子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層中表達(dá)，表明其參與了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)；凋亡效應(yīng)物Caspase-3僅在子宮內(nèi)膜上皮表達(dá)，而Caspase-9在子宮內(nèi)膜上呈陰性，但在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)率較高。表明在牦牛胚胎附植過程中，子宮上皮細(xì)胞和胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)不同的通路發(fā)