基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌發(fā)育毒性作用及其定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞測(cè)試(embryonic stem cell test，EST)體系以胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cell，ES cell)分化為心肌細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，是歐洲代替方法驗(yàn)證中心(theEuropean Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)提出的作為體外篩選和評(píng)價(jià)受試物(包括藥物或環(huán)境中化合物等)可能具有的發(fā)育毒性手段。該體系能基本模擬乃至重現(xiàn)體內(nèi)

2、心肌分化和發(fā)育復(fù)雜全程，富含大量心肌發(fā)育依賴性生物信息，與體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)相比，具有對(duì)藥物作用反應(yīng)迅速、干擾因素少、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 全氟烷基化合物(Polyfluorinated Alkyl Substances，PFAS)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)消費(fèi)，包括全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulfonate，PFOS)，全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，PFOA)，全氟丁基磺酸(Perf

3、luorobutane Sulfonate，PFBS)等。該類(lèi)化合物大量使用致使其以各種途徑進(jìn)入全球范圍內(nèi)各種環(huán)境介質(zhì)如水體、土壤、大氣中，并通過(guò)食物鏈傳遞放大生物效應(yīng)，目前在人體以及許多動(dòng)物組織中均發(fā)現(xiàn)濃度較高PFOS和PFOA存在。這類(lèi)化合物在自然環(huán)境和生物體內(nèi)具不分解性和很高的生物積累能力，其所造成的全球性生態(tài)污染已成事實(shí)，這是直接關(guān)系到人類(lèi)健康的重要問(wèn)題。已有文獻(xiàn)報(bào)道PFOS具有發(fā)育毒性、生殖毒性、心血管毒性、神經(jīng)毒性等多重毒性

4、效應(yīng)，被認(rèn)為是一類(lèi)具有全身多臟器毒性化合物。雖然研究者已經(jīng)掌握了一些關(guān)于PFOS發(fā)育毒理學(xué)研究資料，但還處于初始階段，且多限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。PFOS引起的發(fā)育毒性作用機(jī)制和敏感指標(biāo)還遠(yuǎn)未完全清楚。氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記(Stable Isotope Labeling with AminoAcidsin Cell Cultures，SILAC)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的比較蛋白組學(xué)新方法，可以對(duì)低豐度蛋白質(zhì)直接捕獲和快速定性、定量鑒定分析，快速找出

5、重要功能蛋白質(zhì)。目前尚未見(jiàn)利用EST系統(tǒng)預(yù)測(cè)全氟烷基化合物對(duì)心肌發(fā)育毒性作用研究報(bào)道，也未見(jiàn)利用SILAC標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究該類(lèi)化合物毒性作用機(jī)制，亟待深入探索加以論證。
　　 基于上述背景，本學(xué)位論文主要利用EST模型從細(xì)胞毒性、分化抑制、基因蛋白表達(dá)不同水平系統(tǒng)論證全氟烷基系列化合物PFOS、PFOA和PFBS心肌發(fā)育毒性作用強(qiáng)弱等級(jí)及構(gòu)效關(guān)系。為進(jìn)一步重點(diǎn)考察PFOS對(duì)心肌發(fā)育毒性作用的具體分子機(jī)制，我們采用SIL

6、AC標(biāo)記的蛋白組學(xué)方法定量研究PFOS干預(yù)ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞前后差異表達(dá)蛋白圖譜。采用GO分類(lèi)方法探討差異蛋白的細(xì)胞位置、基因參與的生物過(guò)程、發(fā)揮的分子功能，通過(guò)Pathway分析PFOS對(duì)不同通路的影響，通過(guò)Network分析差異基因的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，并采用Western Blot法對(duì)差異蛋白予以驗(yàn)證。研究結(jié)果將有利于揭示PFOS引起心肌發(fā)育毒性作用的早期分子事件和毒性敏感指標(biāo)。同時(shí)有利于將EST作為一種有效的毒性評(píng)價(jià)體系在化合物

7、成藥性或環(huán)境毒物對(duì)心肌毒性預(yù)測(cè)性評(píng)估中的推廣應(yīng)用。
　　 目的：利用EST模型從細(xì)胞毒性、分化抑制、基因蛋白表達(dá)不同水平評(píng)價(jià)全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS對(duì)小鼠胚胎干(Mouse Embryonic Stem，mES)細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的發(fā)育毒性作用，分析該類(lèi)化合物致心肌發(fā)育毒性的構(gòu)效關(guān)系。并利用SILAC標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)探討PFOS致心肌發(fā)育毒性作用機(jī)制。
　　 方法：利用經(jīng)典的懸滴培養(yǎng)法建立EST

8、模型，加入不同濃度的青霉素、DPH、5-FU以及全氟烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS，檢測(cè)受試物對(duì)mES定向心肌分化能力的影響獲得產(chǎn)生50％ mES細(xì)胞分化抑制作用的濃度ID50 D3；采用MTT法檢測(cè)受試物對(duì)ES細(xì)胞和3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性獲得產(chǎn)生50%細(xì)胞毒性作用的濃度IC50D3和IC503T3，經(jīng)發(fā)育毒性計(jì)算公式計(jì)算，并依據(jù)發(fā)育毒性判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定受試物的發(fā)育毒性等級(jí)，并分析全氟烷基化合物致心肌發(fā)育毒性構(gòu)效關(guān)系。
　　

9、利用SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)考察PFOS干預(yù)ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞前后差異表達(dá)蛋白圖譜，分別用含輕型穩(wěn)定同位素(天然穩(wěn)定同位素)和重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記必需氨基酸的培養(yǎng)基，對(duì)mES分別進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞標(biāo)記完全后(標(biāo)記率90%以上)，將經(jīng)過(guò)輕、重型同位素標(biāo)記的兩組細(xì)胞進(jìn)行懸滴、懸浮、貼壁培養(yǎng)，設(shè)定輕型同位素標(biāo)記細(xì)胞為溶劑對(duì)照組，重型同位素標(biāo)記細(xì)胞用PFOS處理。化合物處理10天后收集樣本，分別提取蛋白等比例混合后經(jīng)SDS-PAGE分離，

10、酶解提取肽，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜圖上每對(duì)輕重穩(wěn)定同位素峰比例可反映對(duì)應(yīng)蛋白在PFOS作用后的表達(dá)變化。根據(jù)每個(gè)鑒定蛋白至少包含兩段鑒定多肽，且溶劑對(duì)照組(DMSO)和實(shí)驗(yàn)組(PFOS)差異1.5以上的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選差異蛋白。用Gene Ontology annotations軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能分類(lèi)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析以及文獻(xiàn)查閱來(lái)確定差異蛋白的功能，揭示PFOS致心肌發(fā)育毒性部分作用靶標(biāo)。
　　 基于蛋白組學(xué)的結(jié)果，選取了活性氧

11、信號(hào)通路以及OCT4甲基化方面與PFOS心肌發(fā)育毒性作用的相關(guān)性進(jìn)行了探討。主要利用Western Blot方法和RT-PCR方法進(jìn)行重要蛋白的驗(yàn)證。通過(guò)DCF-DA檢測(cè)PFOS作用后擬胚體EBs內(nèi)ROS含量。
　　 結(jié)果：通過(guò)EST模型評(píng)價(jià)了青霉素(Penicillin G)、苯妥英(Phenytoin，DPH)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)心肌發(fā)育毒性，三者IC50D3依次為6981、246和0.3

12、6μM，IC503T3分別為6370、240和0.45μM，ID50D3分別為4626、99和0.31μM，心肌發(fā)育毒性等級(jí)分別為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，該模型通過(guò)有效性驗(yàn)證，適用于全氟烷基化合物PFBS、PFOA和PFOS心肌發(fā)育毒性評(píng)價(jià)。受試化合物PFBS、PFOA和PFOS的IC50D3依次為4139、470和291μM，IC503T3分別為5980、484和435μM，ID50D3分別為808、223和40μM，心

13、肌發(fā)育毒性等級(jí)分別為一級(jí)、二級(jí)、二級(jí)。三者心肌發(fā)育毒性強(qiáng)弱順序?yàn)镻FOS>PFOA>PFBS，且具有一定構(gòu)效關(guān)系，即碳鏈越長(zhǎng)心肌發(fā)育毒性越大，末端磺?；募“l(fā)育毒性大于未磺酰化。
　　 從形態(tài)上觀察，PFOS作用ES細(xì)胞后，影響擬胚體(embryoid bodies，EBs)形態(tài)，濃度越大，EBs半徑越小。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著PFOS濃度增加，中胚層基因Brachury及心肌特異性基因α-MHC表達(dá)下降，且呈濃度依賴性

14、。Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示，PFOS使心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C呈濃度依賴性表達(dá)下調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)PFOS使表達(dá)心肌特異性蛋白α-actinin的心肌細(xì)胞數(shù)量呈濃度依籟性下調(diào)。
　　 SILAC標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，PFOS作用后與溶劑對(duì)照組比較，mES分化為心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜存在明顯差異。共篩選出176個(gè)差異蛋白，PFOS作用后67個(gè)蛋白上調(diào)和109個(gè)蛋白下調(diào)。對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分

15、析顯示，在分子功能方面有13個(gè)分類(lèi)，在細(xì)胞定位方面有12個(gè)分類(lèi)，在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程方面有10個(gè)分類(lèi)。將差異蛋白對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行KEGG通路分析，共篩選到31個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義的信號(hào)通路，主要涉及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝、能量代謝及酶代謝相關(guān)通路。在網(wǎng)絡(luò)分析圖中，差異蛋白對(duì)應(yīng)基因與基因組中其他基因的相互作用共涉及到118個(gè)蛋白1296個(gè)相互作用，其中與發(fā)育相關(guān)差異基因與其他基因的相互作用涉及32個(gè)蛋白469個(gè)相互作用。
　　 基于上述蛋白

16、組學(xué)結(jié)果，選取了活性氧信號(hào)通路以及OCT4甲基化方面探討相關(guān)毒性作用機(jī)制。對(duì)差異蛋白Dnmt3b、Dnmt3a、SOD2、Hsp27、MYH10及其相關(guān)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，PFOS作用后Dnmt3b、Dnmt3a蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，Dnmt3b在第3、5、6d均有明顯下調(diào)，而Dnmt3a在第6d明顯下調(diào)，而OCT4在第5、6d上調(diào)。PFOS使SOD2、Hsp27上調(diào)，SOD在第3、5d上調(diào)明顯，Hsp27的磷酸化形式在全程均成上調(diào)趨勢(shì)，致使在

17、心肌分化過(guò)程中ROS減少，導(dǎo)致ERK1/2、p38MAPK磷酸化降低，進(jìn)而使下游GATA4、MEF2C、α-MHC、α-actinin、MYH10表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.基于EST體系測(cè)得PFOS、PFOA、PFBS心肌發(fā)育毒性分別為二級(jí)、二級(jí)、一級(jí)，心肌發(fā)育毒性強(qiáng)弱順序?yàn)镻FOS>PFOA>PFBS，構(gòu)效關(guān)系為碳鏈越長(zhǎng)心肌發(fā)育毒性越大，末端磺?；募“l(fā)育毒性大于未磺?；?br>　　 2.通過(guò)SILAC標(biāo)

18、記的定量蛋白組學(xué)構(gòu)建了PFOS對(duì)ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜，通過(guò)質(zhì)譜共鑒定出176個(gè)差異蛋白，其中67個(gè)蛋白上調(diào)和109個(gè)蛋白下調(diào)。差異蛋白涉及31個(gè)生化和信號(hào)通路，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中共包含118個(gè)蛋白1296個(gè)相互作用。
　　 3.PFOS持續(xù)作用使清除活性氧相關(guān)蛋白SOD2、Hsp27表達(dá)增加，EBs中ROS含量降低，致使p38MAPK通路活化受阻，從而抑制心肌分化。另一方面，PFOS可使DNA甲基轉(zhuǎn)移