腹瀉性貝毒對(duì)ICR小鼠毒性的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、腹瀉性貝毒是目前分布最廣、危害最大的一類藻類毒素，世界各地都有因食用被腹瀉性貝毒污染的貝類所引起的中毒事件的報(bào)道。腹瀉性貝毒在我國(guó)沿海廣泛存在，已嚴(yán)重威脅到我國(guó)近海的生態(tài)系統(tǒng)、漁業(yè)資源以及人民的身體健康和生命安全。本論文選擇腹瀉性貝毒的代表性成分—大田軟海綿酸(Okadaic acid，OA)為受試物，以雄性小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法—熒光差異凝膠電泳技術(shù)(2-D DIGE)結(jié)合生物質(zhì)譜分析，研究腹瀉性貝毒對(duì)小鼠的毒性效應(yīng)，

2、重點(diǎn)研究腹瀉性貝毒急、慢性暴露下小鼠肝臟和小腸蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，尋找、鑒定差異表達(dá)蛋白并分析其參與的生物學(xué)和生理學(xué)過(guò)程，結(jié)合傳統(tǒng)毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，揭示腹瀉性貝毒對(duì)小鼠的分子毒理效應(yīng)，為腹瀉性貝毒的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)，豐富赤潮毒素生態(tài)毒理學(xué)的研究?jī)?nèi)涵。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)小鼠經(jīng)750μg/kg OA一次性經(jīng)口灌胃后，出現(xiàn)明顯的腹瀉、活動(dòng)減少以及精神萎靡等癥狀，同時(shí)伴隨著脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及蛋白磷酸酶活性下降。此外，

3、OA通過(guò)破壞小腸細(xì)胞微絨毛、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能而對(duì)小腸細(xì)胞造成損傷，從而影響小腸的吸收功能并導(dǎo)致腹瀉。
　　(2)運(yùn)用2-D DIGE方法結(jié)合基質(zhì)輔助飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)分析，比較研究了OA急性暴露后小鼠小腸蛋白表達(dá)譜的變化，共鑒定到58個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些蛋白參與了大分子代謝、細(xì)胞骨架構(gòu)建、氧化應(yīng)激響應(yīng)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程。表明OA誘導(dǎo)的急性毒性作用復(fù)雜多樣，涉及到不同的生物學(xué)通路

4、。其中，絨毛蛋白和異質(zhì)核糖核蛋白可作為OA急性毒性的潛在生物標(biāo)志物。
　　(3)不同劑量(0μg/kg、0.2μg/kg、2μg/kg和10μg/kg) OA慢性暴露120 d后，OA誘導(dǎo)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致肝臟蛋白磷酸酶活性下降，肝臟結(jié)構(gòu)破壞如肝細(xì)胞呈空泡化、炎性病灶和雙核細(xì)胞增加，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、內(nèi)嵴脫落等，同時(shí)肝細(xì)胞凋亡增加。此外，OA慢性暴露對(duì)小腸絨毛也造成部分損傷，但并未檢測(cè)到小腸蛋白磷酸酶活性的變化，表明OA慢

5、性暴露對(duì)小腸的毒性不依賴于蛋白磷酸酶活性的抑制作用。
　　(4)運(yùn)用2-D DIGE方法結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS生物質(zhì)譜分析，比較研究了OA慢性暴露下小鼠肝臟蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，成功鑒定到46個(gè)差異蛋白。這些差異蛋白主要參與生物大分子代謝、細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。表明OA通過(guò)抑制氨基酸、糖類和脂質(zhì)代謝以及三羧酸循環(huán)從而導(dǎo)致能量失衡，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并在氧化過(guò)程中產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)

6、網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡造成肝細(xì)胞損傷，合并細(xì)胞骨架的破壞，從而對(duì)小鼠肝臟產(chǎn)生毒性效應(yīng)。分子伴侶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)性凋亡過(guò)程中起著主要的調(diào)節(jié)作用。此外，本研究中鑒定到的微管蛋白等表達(dá)受到蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)。因此，OA不僅能夠調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)水平，也可能通過(guò)調(diào)節(jié)其磷酸化水平來(lái)共同影響細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)。
　　(5)運(yùn)用2-D DIGE方法結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS生物質(zhì)譜分析，比較研究了OA慢性暴露下小鼠小腸