小麥籽粒中淀粉去分支酶的活性差異、類型及作用機(jī)制的研究.pdf

1、淀粉去分支酶(DebranchingEnzyme,DBE)是小麥支鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶。本文在優(yōu)化小麥中淀粉去分支酶提取以及活性分析條件的基礎(chǔ)上，比較了不同小麥品種和不同灌漿時期淀粉去分支酶活性的變化，并對小麥中淀粉去分支酶進(jìn)行了分離純化和有關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究，以期為今后深入研究小麥支鏈淀粉合成機(jī)理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：1小麥中淀粉去分支酶的提取和活性分析條件的優(yōu)化 以純的商品化的馬鈴薯支鏈淀粉為底物，對小麥中淀粉去分支酶

2、提取和活性分析條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，巰基乙醇加入量對酶活性影響較大。隨著巰基乙醇加入量的增大，酶活性呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)巰基乙醇加入量達(dá)到50mmol/L，酶活性達(dá)到最大值。再增加巰基乙醇的濃度，對酶活性僅具有穩(wěn)定作用。緩沖液的類型和pH值對酶活性也有較大影響，隨著pH值的增大，酶活性均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)緩沖液為MES-NaOH，pH為6.5時酶活性達(dá)到最大值。 酶促反應(yīng)以30℃為宜，在此條件下反應(yīng)120min內(nèi)酶活性

3、分析結(jié)果具有穩(wěn)定性。 據(jù)此，小麥中淀粉去分支酶提取條件為：巰基乙醇加入量為50mmol/L，以pH為6.5的MES-NaOH作為提取緩沖液；而小麥淀粉去分支酶活性分析條件為：酶促反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時間為120min內(nèi)，測定波長為540nm。 2不同品種小麥淀粉去分支酶在不同時期的活性變化以四個小麥品種(糯)麥1號、關(guān)東107、魯麥21、濟(jì)南16為材料，其中糯麥1號為全糯性小麥，關(guān)東107為部分糯性小麥，后兩種為普通小

4、麥。研究了不同品種小麥淀粉去分支酶在不同時期的活性變化。研究表明，小麥開花至成熟的全過程中，淀粉去分支酶的活性變化呈單峰曲線。從曲線的形式來看，四種小麥的淀粉去分支酶，在灌漿的不同時期其活性變化趨勢大體上一致，表現(xiàn)為：開花后活性快速上升，在開花后14d前后達(dá)到峰值，然后下降，但保持在較高水平，隨著小麥的成熟，開花35d后活性下降迅速。 3小麥淀粉去分支酶的分離純化采用硫酸銨沉淀法和DEAE-Cellulose離子交換層析法對小麥

5、中淀粉去分支酶進(jìn)行分離純化，得到異淀粉酶和極限糊精酶兩個酶組分，利用SephacrylS-200聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱層析對主要組分異淀粉酶進(jìn)一步純化，能得到純度較高的異淀粉酶，該酶的純化倍數(shù)提高了3.66倍，得率為10，酶比活為4.021U/μgProtein。 4異淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究異淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該酶最適pH為6.5，最適溫度為30℃，熱穩(wěn)定范圍在30-40℃之間，其分子量大約為89.9kDa和56.8kDa

6、，對其底物-支鏈淀粉的米氏常數(shù)為8.045mg/mL，最大反應(yīng)速度為12.24U/L。Hg2+和Cu2+對此酶有很強(qiáng)的抑制作用，Na+、Mg2+等對此酶幾乎無抑制作用，而甘油和巰基乙醇對此酶有穩(wěn)定作用，純化過程中能保持該酶的活性。異淀粉酶在4℃下保存一個月，其活性仍在80％以上。 5淀粉去分支酶對其底物-支鏈淀粉的酶解性質(zhì)研究四種小麥粗酶液酶解支鏈淀粉后產(chǎn)物的液相色譜圖，其趨勢相似，具有明顯的兩個峰，保留時間分別為3-5min和

7、16-18min之間。與三種糖標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線相比，可知與第一個峰相對應(yīng)的物質(zhì)為葡萄糖。說明盡管四個小麥品種的淀粉組分差異很大，但他們的淀粉去分支酶對底物支鏈淀粉都有相似的酶解活性。 糯麥1號和魯麥21兩個品種小麥的粗酶液經(jīng)DEAE-Cellulose部分純化，得到有活性的異淀粉酶作用于支鏈淀粉，有HPLC圖譜可以看出，這兩個品種小麥淀粉去分支酶經(jīng)部分純化后也具有相似趨勢的圖譜，但具有相似的四個峰，其中第一個峰和最后一個峰與未純化酶