突觸體素-Cdk5介導(dǎo)炎性疼痛的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 慢性炎性疼痛由于其發(fā)病機制復(fù)雜目前并無理想的治療靶點，但近年的大量的研究結(jié)果表明中樞系統(tǒng)的突觸可塑性是慢性疼痛產(chǎn)生痛覺敏化的基礎(chǔ)。突觸可塑性的形成和維持主要依賴于突觸前的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間隙的傳遞以及神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后神經(jīng)元受體結(jié)合的過程。因此調(diào)控突觸前的突觸囊泡神經(jīng)遞質(zhì)持續(xù)的釋放是調(diào)控突觸可塑性形成的關(guān)鍵因素，這可能成為治療慢性炎性疼痛的治療靶點。
　　 細胞周期素性依賴蛋白激酶-5(cyc

2、lin-dependent kinase-5，Cdk5)屬于絲氨酸和酸酸家族，其主要分布在后有絲分裂神經(jīng)元。在后有絲分裂神經(jīng)元Cdk5酶的活性主被激活子p35或者p39激活。p35和p39鈣蛋白酶(calpain)作用下裂解為p25和p29。既往的研究結(jié)果表明Cdk5在調(diào)控神經(jīng)元的生長發(fā)育和遷移具有重要的作用。但近期的試驗數(shù)據(jù)揭示Cdk5在調(diào)控炎性疼痛的熱痛覺敏化具有重要作用調(diào)控作用而對機械痛則影響。在小鼠足底注射辣椒素(capsaic

3、in)后，小鼠背根神經(jīng)節(jié)的Cdk5被激活并通過磷酸化的背根神經(jīng)節(jié)的辣椒素受體調(diào)控capsaicin足底注射致的熱痛覺敏化。而大鼠足底注射完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant，CFA)導(dǎo)致脊髓后角的Cdk5酶的活性增高，給與Cdk5抑制劑Roscovitine可以明顯的抑制完全弗氏佐劑導(dǎo)致的熱痛覺敏化。盡管如此，Cdk5調(diào)控炎性疼痛的機制目前仍不清楚，有研究結(jié)果表明海馬中樞突觸前的Cdk5成為調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)釋放

4、的主控點。眾所周知N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體復(fù)合體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)是突觸囊泡釋神經(jīng)遞質(zhì)的中心和靶控點而突觸體(synaptophysin)是SNARE形成的關(guān)鍵因素。近期的研究結(jié)果表明在海馬皮層CA1區(qū)基因敲除Cdk5導(dǎo)致突觸體素蛋白表達明顯下降。在慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(chronic

5、constriction injury，CCI)模型中，大鼠脊髓后角的synaptophysin蛋白表達與CCI所致的熱痛閾變化呈明顯的線性相關(guān)。
　　 基于已有的研究結(jié)果，我們提出如下假設(shè):在脊髓水平上Cdk5調(diào)控炎性疼痛可能通過調(diào)控synaptohysin的功能調(diào)節(jié)調(diào)控炎性疼痛。這可能成為Cdk5調(diào)控炎性疼痛的機制之一。
　　 試驗方法:
　　 1.炎性疼痛模型的建立: SD雄性大鼠(200-250g)分為試

6、驗組和對照組。實驗組大鼠左后足底注射完全弗氏佐劑100μL，右足底注射生理鹽水100μL作為對照(n=6)，對照組的大鼠左后足底和右后足底分別注射生理鹽水100μL作為對照(n=6)。
　　 2.大鼠鞘內(nèi)置管:為了給與大鼠脊髓鞘內(nèi)注射藥物，按照Yaksh改良法給與不同組的大鼠脊髓鞘內(nèi)置管。
　　 3.大鼠傷害性行為學(xué)的觀察:
　　 3.1.試驗組和對照組的大鼠分別放置在單個觀察箱內(nèi)測試熱縮腳潛伏期的閾值。

7、　　 3.2.Cdk5選擇性抑制Roscovitine100μg和等容量的DMSO分別給與大鼠脊髓鞘內(nèi)注射，然后兩組大鼠分別給與熱輻射刺激后觀察它們的熱縮腳潛伏期的閾值(n=6/group)。
　　 4.分子生物學(xué)試驗:
　　 4.1.免疫共定位:SD大鼠共6組(n=3/group)。大鼠在組織灌注后取同側(cè)的脊髓后角在經(jīng)過免疫熒光組織化學(xué)的步驟處理后。通過共聚顯微鏡觀察Cdk5與p35，synaptophysin， S

8、NAP-25和sytaxion1A共定位的關(guān)系。
　　 4.2.Western blot試驗:在行為學(xué)測試后取不同組別大鼠脊髓后角蛋白定量后通過Western blot的方法檢測各組的synaptophysin，p35和p25蛋白的變化。
　　 4.3.Cdk5酶的活性的分析:通過免疫沉淀的方法后通過Western blot檢測Cdk5酶的底物HistoneH1底物磷酸化的水平，HistoneH1為內(nèi)參對照。
　　

9、 4.結(jié)果:
　　 1.Cdk5與p35，synaptophysin，SNAP-25和sytaxion1A在大鼠同側(cè)的脊髓后角神經(jīng)元完全共定位。
　　 2.大鼠足底CFA注射導(dǎo)致大鼠的熱縮腳潛伏期閾值與對照組比明顯下降，其下降的閾值在第6小時和24小時最為顯著，在第3天開始升高并到達平臺期后一直持續(xù)到第5天（**p＜0.01）。大鼠脊髓鞘內(nèi)注射Roscovitine100μg與鞘內(nèi)注射DMSO相比顯著地提高CFA足底注

10、射所致的下降的熱縮腳潛伏期的閾值（**p＜0.01）。大鼠脊髓鞘內(nèi)注射Roscovitine對足底注射生理鹽水的大鼠的同側(cè)和對側(cè)的熱縮腳潛伏期閾值沒有顯著的影響(p＞0.05)。
　　 3.Synaptophysin蛋白的表達與對照組比較從CFA足底注射6小時一直到第3天明顯增加（*p＜0.05，**p＜0.01）。在大鼠足底注射CFA第5天synaptiphysin表達回到對照組的基線附近。Synaptophysin不同時間點

11、的蛋白表達與CFA足底注射后大鼠的熱縮腳潛伏期閾值的變化呈明顯的線性相關(guān)（**p＜0.001）。鞘內(nèi)注射Roscovitine100μg明顯的抑制大鼠脊髓后角synaptophysin的蛋白高表達（*p＜0.05，*p＜0.01），這表明Cdk5選擇性抑制劑可以明顯地抑制synaptophysin的蛋白表達。
　　 4.鈣調(diào)蛋白酶(calpain)在CFA足底注射6h與對照組相比顯著增高（*p＜0.05），而在第1d，3d則沒有

12、明顯的變化(p＞0.05)。
　　 5.Cdk5酶的活性在CFA足底注射后從6小時一直到第5天，Cdk5酶的活性與對照組相比明顯的增加（*p＜0.05，**p＜0.01）。Roscovitine100μg提前于CFA足底注射30分鐘進行脊髓鞘內(nèi)注射后1天明顯地抑制Cdk5酶的活性（*p＜0.05）。同時在1天的時間點p25表達增加而p35的表達與則沒有明顯的變化。大鼠脊髓鞘內(nèi)注射Roscovitine100μg顯著的抑制P25的

13、蛋白地表達（**p＜0.01），而對p35的蛋白表達則沒有明顯的影響(p＞0.05)。Cdk5酶的活性表達與大鼠的熱縮腳潛伏期閾值和synaptophysin的蛋白的表達呈明顯的線性相關(guān)（**p＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 Synaptophysin參與了大鼠CFA足底注射所致的熱痛覺敏化的形成。Cdk5可能通過調(diào)控突前的synaptophysin功能調(diào)控CFA足底注射所致的炎性疼痛。因此阻斷Cdk5/synapt