TRPV4介導(dǎo)的小鼠氣管平滑肌舒張機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　闡明花生四烯酸細(xì)胞色素P450（cytochrome P450,CYP）表氧化酶代謝產(chǎn)物14,15-環(huán)氧化二十碳三烯酸（14,15-epoxyeicosatrienoic acid，14,15-EET）對(duì)小鼠氣管平滑肌收縮功能的影響及其機(jī)制。本研究采用離體氣管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀法檢測(cè)14,15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的影響以及TRPV4（transient receptor potential vani

2、lloid4，TRPV4）通道蛋白與小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（small conductance Ca2+-activated K+channels,SKCa）蛋白在小鼠氣管平滑肌組織中的相互作用。
　　方法:
　　1.離體氣管環(huán)制備
　　雄性小鼠，昆明種，體重在20～25g，清潔級(jí)，6周齡。經(jīng)CO2窒息法處死后，迅速取出喉部以下主支氣管，放入通有混合氣體(95％ O2和5% CO2)的Krebs-Henseleit緩沖液中

3、，維持pH在7.4±0.05。輕柔地去除氣管外周結(jié)締組織，用粗糙的金屬絲小心去除氣管內(nèi)皮，然后沿縱軸將氣管剪成長(zhǎng)約2mm氣管環(huán)。
　　2.等長(zhǎng)張力實(shí)驗(yàn)
　　運(yùn)用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采集張力信號(hào)數(shù)據(jù)，記錄經(jīng)不同阻斷劑和300nmol/L14,15-EET預(yù)處理后，不同濃度卡巴膽堿的量效關(guān)系。
　　3.免疫共沉淀
　　使用免疫共沉淀方法檢測(cè)TRPV4和SKCa蛋白在小鼠氣管平滑肌中是否存在相互作用。

4、　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以-x±s，并運(yùn)用SigmaPlot12.5軟件進(jìn)行多因素方差分析作圖，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1.卡巴膽堿可以濃度依賴的引起小鼠氣管環(huán)收縮（10-10～10-3 mol/L），與對(duì)照組相比，300nmol/L14,15-EET預(yù)處理使卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮顯著減弱（*P<0.05）。
　　2.大、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道阻斷劑50μmol/L I

5、bTX和10μmol/L TRAM-34沒(méi)有顯著影響300nmol/L14,15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制效應(yīng)；而SKCa阻斷劑1μmol/L Apamin顯著阻斷了14,15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制作用（*P<0.05）。
　　3.TRPV4通道阻斷劑20μmol/L RN-1734與對(duì)照組相比，明顯減弱了14,15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制效應(yīng)（*P<0.05）。
　　4

6、. TRPV4蛋白和SKCa通道蛋白第三亞型SK3可以彼此相互共沉淀，TRPV4通道蛋白與SKCa通道蛋白存在相互作用。
　　結(jié)論:
　　在小鼠氣管平滑肌中，14,15-EET通過(guò)TPRV4-SKCa鈣信號(hào)復(fù)合物調(diào)節(jié)氣管平滑肌的收縮。
　　目的：
　　TRPV4作為非選擇性陽(yáng)離子通道對(duì)鈣離子具有較高通透性，且在組織內(nèi)分布廣泛。被敏感性刺激激活后，通道開(kāi)放引起胞漿內(nèi)鈣離子濃度顯著升高，鈣離子濃度變化會(huì)直接影響氣道平

7、滑肌的收縮/舒張狀態(tài)。胞內(nèi)1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）可以激活三磷酸肌醇受體（IP3R）介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子由肌質(zhì)網(wǎng)釋放。TRPV4通道激活導(dǎo)致的鈣離子內(nèi)流，引起局部Ca2+濃度增加，可以促進(jìn)Na+/Ca2+交換體（NCX2）發(fā)揮作用。因而，本實(shí)驗(yàn)利用離體小鼠氣管環(huán)張力測(cè)定、免疫共沉淀等方法，觀察在小鼠氣管收縮調(diào)節(jié)中TRPV4、IP3R1、NCX2是否存在相互作用。
　　方法：
　　1.離體氣管環(huán)制備
　　同第一部分實(shí)

8、驗(yàn)方法。
　　2.等長(zhǎng)張力實(shí)驗(yàn)
　　BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)采集張力信號(hào)數(shù)據(jù)，記錄不同藥物處理和卡巴膽堿收縮后，不同濃度TRPV4通道激動(dòng)劑GSK1016790A對(duì)氣管舒張作用的量效關(guān)系。
　　3.免疫共沉淀
　　使用免疫共沉淀方法檢測(cè)TRPV4和NCX2及IP3R1蛋白在小鼠氣管平滑肌中是否存在相互作用。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以-x±s，并運(yùn)用SigmaPlot12.5軟件進(jìn)

9、行多因素方差分析作圖，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.TRPV4通道激動(dòng)劑GSK106790A可以濃度依賴的使卡巴膽堿收縮的小鼠氣管環(huán)舒張，與對(duì)照組相比，NCX阻斷劑5μmol/L KB-R7943和LiCl預(yù)處理引起的小鼠氣管舒張顯著被抑制（*P<0.05）。
　　2.與對(duì)照組相比，TRPV4通道阻斷劑10μmol/L HC067047預(yù)處理后，GSK106790A引起的小鼠氣管舒張作用顯著

10、減弱（*P<0.05）。
　　3.與對(duì)照組相比，4μmol/L TG預(yù)處理后，明顯抑制了GSK106790A引起的小鼠氣管的舒張效應(yīng)（*P<0.05）。
　　4.與對(duì)照組相比，10μmol/L Ryanodine預(yù)處理后，對(duì)GSK106790A引起的小鼠氣管舒張作用沒(méi)有顯著效應(yīng)。
　　5.TRPV4蛋白和IP3R1通道蛋白及NCX蛋白第二亞型NCX2可以彼此相互共沉淀，存在相互作用。
　　結(jié)論：
　　在小鼠