糖尿病小鼠主動脈平滑肌ROS-NFκB信號通路對MuRF1介導BK-β1降解的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病已成為日益嚴重的全球性健康負擔。據(jù)統(tǒng)計2013年全球患糖尿病的總?cè)藬?shù)為3.82億，預期到2035年，患糖尿病的人數(shù)可能達到5.92億。糖尿病是世界范圍內(nèi)致殘率和致死率的主要原因，是心血管疾病的獨立危險因素。眾所周知，糖尿病可改變血管的結(jié)構(gòu)和功能，與糖尿病血管并發(fā)癥如冠心病、視網(wǎng)膜病變、腦血管意外、糖尿病腎病有著緊密關系。糖尿病導致血管功能障礙的機制包括內(nèi)皮依賴的和內(nèi)皮非依賴的機制，內(nèi)皮依賴的血管功能障礙的分子

2、機制已經(jīng)得到了充分的論證與研究，但是內(nèi)皮非依賴的分子機制研究較少。大電導鈣激活鉀通道（ Large conductance Ca2+-activated K+channel，BK）廣泛表達于血管平滑肌細胞，是血管張力維持的重要決定因素，BK通道的活性受到其β1亞基（BK-β1）的調(diào)節(jié)。越來越多的證據(jù)顯示，1型和2型糖尿病血管損傷的普遍特征是BK-β1表達的降低。肌肉環(huán)指蛋白1（Muscle RING finger protein1, M

3、uRF1）是泛素蛋白酶途徑（ubiquitin proteasome pathway, UPP）中肌肉特異的泛素連接酶（Ubiquitin-protein ligase，E3s），參與多種心臟和骨骼肌疾病的發(fā)病，同樣也表達于血管平滑肌細胞。有研究發(fā)現(xiàn)， MuRF1的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與BK-β1的N端有物理性接觸，MuRF1可能參與了糖尿病血管BK-β1的蛋白水解，導致BK通道活性的下調(diào)和血管功能的損傷。同時， MuRF1蛋白

4、表達受到核因子κB（NFκB）的調(diào)控，其機制與心肌和骨骼肌萎縮密切相關。另外，糖尿病血管中可以產(chǎn)生過多活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）， ROS通過多種途徑可激活NFκB。但是由于細胞類型的不同，ROS/NFκB信號通路是否參與了糖尿病小鼠主動脈平滑肌MuRF1介導的BK-β1降解我們不得而知。
　　研究目的：
　　探討糖尿病小鼠主動脈平滑肌ROS/NFκB信號通路對MuRF1介導BK-β

5、1降解的調(diào)控機制。
　　研究方法：
　　1．腹腔注射鏈脲霉素制備1型糖尿病小鼠模型，動物實驗分為2組：①對照組；②糖尿病組。細胞實驗分為2組：①低糖組；②高糖組。酶消法急性分離小鼠胸主動脈平滑肌細胞，膜片鉗檢測平滑肌細胞全細胞 BK通道的電流變化；免疫沉淀檢測糖尿病小鼠胸主動脈和高糖培養(yǎng)的MOVAS細胞（小鼠主動脈平滑肌細胞系）BK-β1的泛素化水平； Western blot檢測糖尿病小鼠胸主動脈和高糖培養(yǎng)的 MOVAS細

6、胞BK-β1和MuRF1的蛋白表達水平；Western blot檢測糖尿病小鼠胸主動脈NOX-1、NOX-4、RelA/p65和NFκB1/p50的表達水平。
　　2．觀察MuRF1的下調(diào)對高糖培養(yǎng)的MOVAS細胞中BK-β1表達的影響。實驗分為4組：①低糖+control siRNA組；②低糖+MuRF1 siRNA組；③高糖+control siRNA組；④高糖+MuRF1 siRNA組。向低糖或者高糖培養(yǎng)的 MOVAS細胞轉(zhuǎn)

7、染 control siRNA或MuRF1 siRNA。利用Western blot和細胞免疫熒光檢測BK-β1和MuRF1的蛋白表達水平。
　　3．觀察蛋白酶抑制劑MG132對BK-β1表達的影響。動物實驗分為4組：①對照組；②對照+MG132組；③糖尿病組；④糖尿病+MG132組。對照+MG132組及糖尿病+MG132組的小鼠分別給予腹腔注射MG1320.1 mg/（kg·d）治療12周，對照組和糖尿病組的小鼠用同等體積DMS

8、O腹腔注射治療12周。細胞實驗分為4組：①低糖組；②低糖+MG132組；③高糖組；④高糖+MG132組。低糖+MG132組和高糖+MG132組用10μmol/L的MG132處理24小時。Western blot檢測BK-β1和MuRF1的蛋白表達水平。
　　4．觀察ROS/NFκB信號通路對MuRF1介導的BK-β1降解的調(diào)控作用。實驗分為6組：對照組，對照+N-乙酰半胱氨酸（NAC，ROS清除劑）組，對照+吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽

9、（PDTC，NF-κB抑制劑）組，糖尿病組，糖尿病+NAC組，糖尿病+PDTC組。對照+NAC組和糖尿病+NAC組給予NAC100 mg/（kg·d）腹腔注射治療，對照+PDTC組和糖尿病+PDTC組給予PDTC50 mg/（kg·d）腹腔注射治療，對照組和糖尿病組給予同等體積生理鹽水腹腔注射。給予藥物治療12周后，Western blot和免疫組化檢測胸主動脈 BK-β1、MuRF1、NFκB1/p50的表達水平；動脈血管環(huán)舒張反應性

10、實驗檢測胸主動脈血管環(huán)對BK通道的特異性激動劑NS-1619的反應性；酶消化法急性分離小鼠胸主動脈平滑肌細胞，全細胞膜片鉗實驗記錄小鼠胸主動脈平滑肌細胞BK通道的電流變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1．電流-電壓曲線顯示糖尿病小鼠胸主動脈平滑肌細胞全細胞BK通道電流密度顯著降低（P＜0.05）；免疫沉淀結(jié)果顯示糖尿病小鼠主動脈 BK-β1的泛素化水平增加（P＜0.05），高糖培養(yǎng)的MOVAS細胞BK-β1的泛素化水平增加（P＜0

11、.05）；Western blot結(jié)果顯示糖尿病小鼠主動脈和高糖培養(yǎng)的 MOVAS細胞 BK-β1蛋白表達水平降低（P＜0.05），MuRF1的蛋白表達水平增加（P＜0.05），糖尿病小鼠主動脈 NOX-1、NOX-4、RelA/p65和NFκB1/p50的蛋白表達水平增加（P＜0.05）。
　　2．Western blot結(jié)果顯示，與高糖+control siRNA組相比，轉(zhuǎn)染MuRF1 siRNA的高糖培養(yǎng)的MOVAS細胞Mu

12、RF1蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），BK-β1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）。
　　3．Western blot和電流-電壓曲線結(jié)果顯示，與糖尿病組相比，糖尿病+MG132組BK-β1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）, BK通道電流密度顯著增加；與高糖組相比，高糖+MG132組BK-β1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）。
　　4．與對照組、對照+NAC組和對照+PDTC組相比較，糖尿病組的BK-β1蛋白

13、表達水平顯著降低（P＜0.05），MuRF1和NFκB1/p50的蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05），動脈血管環(huán)對NS-1619的舒張反應性降低（P＜0.05），當刺激電壓＞50 mV時，糖尿病組主動脈平滑肌細胞全細胞BK通道電流密度顯著降低（P＜0.05）；與糖尿病組相比，糖尿病+NAC組及糖尿病+PDTC組 BK-β1蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05）， MuRF1和NFκB1/p50蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），動脈血

14、管環(huán)對NS-1619的舒張反應性有顯著改善（P＜0.05），當刺激電壓＞50 mV時，糖尿病+NAC組及糖尿病+PDTC組全細胞BK通道電流密度顯著增加（P＜0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1．糖尿病小鼠胸主動脈平滑肌BK通道活性受損、BK-β1蛋白表達降低。
　　2．糖尿病小鼠主動脈平滑肌MuRF1對BK-β1亞基降解起到調(diào)控作用。
　　3．NAC和PDTC可抑制糖尿病小鼠胸主動脈平滑肌MuRF1介導的BK-