前列腺癌相關(guān)融合基因TMPRSS2-ERG及循環(huán)microRNA的研究.pdf

1、本文圍繞前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床展開(kāi)，嘗試闡明TMPRSS2—ERG融合基因在前列腺癌發(fā)病中的作用機(jī)制；同時(shí)，針對(duì)當(dāng)前前列腺癌早期診斷中存在的問(wèn)題，試圖發(fā)現(xiàn)可用于前列腺癌診斷的新的生物標(biāo)志物。
　　 1．染色體結(jié)構(gòu)的改變常見(jiàn)于惡性腫瘤細(xì)胞中，其中染色體易位導(dǎo)致原癌基因的融合可能是某些腫瘤發(fā)生的重要原因。2005年，Tomlins等在Science報(bào)道在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)了受雄激素調(diào)控的基因TMPRSS2和原癌基因ETS家族成員發(fā)生了融合

2、，隨后的幾個(gè)獨(dú)立研究結(jié)果顯示該類融合基因在高加索前列腺癌病人群體中的出現(xiàn)比率約為50％—70％，其中最常見(jiàn)的融合類型為T(mén)MPRSS2—ERG，約占50％。近年來(lái)對(duì)TMPRSS2—ERG融合基因功能的研究已初步表明該融合基因?qū)?xì)胞的增殖、分化、侵襲等性狀均具有一定的影響。由于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展一方面體現(xiàn)在不受控的細(xì)胞增殖，另外同樣重要的一個(gè)因素則是腫瘤細(xì)胞的凋亡異常。因此，TMPRSS2—ERG基因是否影響細(xì)胞的凋亡是一個(gè)值得深入研究的問(wèn)題

3、。此外，由于前列腺癌在不同遺傳背景的人種群體間發(fā)病率和致死率差異均較大，而對(duì)這一融合基因的研究以往都以歐美人群為主，亞洲人群，尤其是中國(guó)人群這一融合基因的發(fā)生率如何還不清楚。因此，本論文第一部分的研究?jī)?nèi)容分為兩個(gè)方面，首先篩查融合基因在中國(guó)前列腺癌病人群體中的出現(xiàn)頻率，其次對(duì)TMPRSS2—ERG融合基因是否影響細(xì)胞凋亡進(jìn)行探討。
　　 我們推測(cè)：融合基因TMPRSS2—ERG在中國(guó)前列腺癌病人群體中發(fā)生的頻率可能不同于基于高加

4、索病人群體的檢測(cè)結(jié)果。由于融合基因TMPRSS2—ERG的編碼蛋白和同一家族Fli—1基因編碼蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)域，因此可能和Fli—1類似，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
　　 2．由于目前對(duì)晚期前列腺癌的治療很難達(dá)到理想的效果，所以當(dāng)前更重要的一個(gè)問(wèn)題是該疾病的早期診斷。盡管前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)的檢測(cè)是一種常規(guī)的檢測(cè)手段，但其靈敏性和特異性都欠佳，急需發(fā)現(xiàn)一種更好的檢測(cè)指標(biāo)。近

5、幾年來(lái)，已有許多研究證明在血清或血漿中有穩(wěn)定的循環(huán)microRNAs(miRNAs)存在，進(jìn)一步的研究表明miRNAs具有作為癌癥標(biāo)志物的潛能，并且外周血miRNAs的表達(dá)譜可以區(qū)分各類腫瘤，具有組織特異性。新的證據(jù)顯示糖尿病患者血清miRNA表達(dá)譜與健康對(duì)照比較也有顯著的差異；同時(shí)，miRNAs也可用來(lái)區(qū)分診斷急性肝臟損傷等疾病，并可用作心肌損傷的標(biāo)志物[1—3]。這些研究都表明外周血循環(huán)miRNA具備良好疾病標(biāo)志物的潛能，因此本論文

6、的第二部分中我們檢測(cè)并嘗試篩選出前列腺癌特異性的循環(huán)miRNAs，以驗(yàn)證這些miRNAs潛在的診斷效能。
　　 第一部分前列腺癌融合基因TMPRSS2—ERG的研究
　　 目的：初步評(píng)估TMPRSS2—ETS融合基因在中國(guó)前列腺癌病人群體中的出現(xiàn)頻率，獲得TMPRSS2—ERG融合基因參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的證據(jù)。
　　 方法：
　　 1．前列腺癌穿刺標(biāo)本抽提總RNA，nest—PCR檢測(cè)融合序列，經(jīng)T/A克隆

7、入載體，測(cè)序驗(yàn)證。
　　 2．構(gòu)建融合基因編碼序列△ERG穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的遷移率；CCK—8測(cè)定生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞毒性；Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白；Annexin—V PE和7—AAD雙染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡；siERG轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株介導(dǎo)△ERG基因的表達(dá)下調(diào)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．在我們獲得的27列前列腺癌樣本中檢出6例TMPRSS

8、2—ERG基因融合，占22％，未檢測(cè)到TMPRSS2—ETV1基因融合。5份良性增生(BPH)樣本中未檢測(cè)到融合基因。但在一例前列腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)一種新的融合基因TMPRSS2—EGR1，其功能有待進(jìn)一步的研究。
　　 2．成功構(gòu)建高表達(dá)ΔERG的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和遷移率和空載體對(duì)照細(xì)胞株無(wú)明顯差異。順鉑(cisplatin)處理48h后，△ERG穩(wěn)轉(zhuǎn)株存活率為對(duì)照細(xì)胞株的3倍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的細(xì)胞凋亡率各為25．89±

9、9．66％和67．26±9．07％。在△ERG基因干擾后的試驗(yàn)中其凋亡比率由原來(lái)的41．50±6．70％升至59．64±3．23％。
　　 3．Western Blot結(jié)果顯示△ERG穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞處理后caspase—3和Parp—1的斷裂片段的蛋白量顯著低于對(duì)照細(xì)胞。定量PCR表明與凋亡直接相關(guān)的基因BCL—2，BCL—XL，BAX，BIM與對(duì)照組空載體細(xì)胞株相比都沒(méi)有明顯的表達(dá)變化；間接與凋亡通路相關(guān)的基因ATF—5(acti

10、vating transcription factor5)則上升了2．5倍左右。兩種細(xì)胞DNA損傷指標(biāo)γH2AX的蛋白表達(dá)量則相差1．5倍左右。
　　 結(jié)論：
　　 1．我們的初步篩選結(jié)果表明TMPRSS2—ERG融合基因在中國(guó)前列腺癌病人群體中出現(xiàn)頻率較低，有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 2．在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)一例新的融合基因TMPRSS2—EGR1。
　　 3．TMPRSS2—ERG融合基因T3/E

11、5可編碼N端缺失的ERG蛋白(△ERG)，△ERG可抑制順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，并進(jìn)而抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 第二部分循環(huán)MicroRNA作為前列腺癌診斷指標(biāo)的研究
　　 目的：通過(guò)對(duì)循環(huán)miRNAs的篩查發(fā)現(xiàn)前列腺癌特異性的miRNAs，并驗(yàn)證其診斷效能。
　　 方法：
　　 1．本實(shí)驗(yàn)包括篩選鑒定和獨(dú)立驗(yàn)證兩個(gè)步驟，篩選組由17份正常對(duì)照和25份前列腺癌(CaP)病人的血樣組成，另一組為獨(dú)立驗(yàn)證

12、組，包括44份正常對(duì)照樣本和80份前列腺癌樣本。
　　 2．采用Illumina’s miRNA表達(dá)分析平臺(tái)，篩選前列腺癌患者和正常對(duì)照組之間的循環(huán)miRNAs的表達(dá)譜差異，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR于獨(dú)立的大樣本中進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證差異表達(dá)miRNAs，根據(jù)ROC曲線分析其診斷效能，并用主成分分析法評(píng)估鑒定的6個(gè)miRNAs的聯(lián)合診斷價(jià)值。
　　 結(jié)果：
　　 1．篩選階段在兩種樣本中發(fā)現(xiàn)有8個(gè)miRNAs(let—

13、7c，let—7e，miR—25，miR30c，miR—346，miR—622，mir—940，and miR—1285)表達(dá)水平具有顯著差異，最后驗(yàn)證階段驗(yàn)證獲得6個(gè)miRNAs(let—7c，let—7e，miR30c，miR—622，mir—940，andmiR—1285)。
　　 2．ROC(Receiver operating characteristic)曲線分析顯示6個(gè)miRNAs都具有一定的診斷價(jià)值，曲線下面積(