磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、第一部分P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)及其意義
　　 目的:探討P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)及其意義。
　　 方法:采用免疫組織化學(xué)方法檢測40例后天性中耳膽脂瘤組織和20例正常外耳道皮膚組織中P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白的表達(dá)水平，并分析它們之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:40例中耳膽脂

2、瘤上皮組織標(biāo)本中P-EGFR蛋白陽性率為65.0％(26/40);P-Akt蛋白陽性率為72.5％(29/40);cyclinD1蛋白陽性率為62.5％(25/40);PCNA蛋白陽性率為80.0％(32/40)。對照組20例正常外耳道皮膚組織中P-EGFR蛋白陽性率為20.0％(4/20);P-Akt蛋白陽性率為35.0％(7/20);cyclinD1蛋白陽性率為10.0％(2/20);PCNA蛋白陽性率為45.0％(9/20)。經(jīng)統(tǒng)

3、計(jì)學(xué)分析:P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA四種蛋白在中耳膽脂瘤組和正常外耳道皮膚組中的表達(dá)差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中耳膽脂瘤組中P-EGFR與P-Akt的表達(dá)、P-Akt與cyclinD1的表達(dá)、cyclinD1與PCNA的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達(dá)增高，且中耳膽脂

4、瘤組中P-EGFR與P-Akt的表達(dá)、P-Akt與cyclinD1的表達(dá)、cyclinD1與PCNA的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)，提示中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞中EGFR活化的同時(shí)伴隨著其下游效應(yīng)因子P-Akt、cyclinD1和PCNA的活化。
　　 2.EGFR/PI3K/Akt信號通路可能在中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞過度增殖機(jī)制中起到重要作用，參與了中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制。
　　 第二部分人正常外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定
　　

5、 目的:建立人正常外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞(humanextemalearcanalkeratinocytes)原代培養(yǎng)體系，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征與生物學(xué)特性，并對原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法:取中耳手術(shù)耳甲腔成形時(shí)切取的外耳道口皮膚作組織塊培養(yǎng)，經(jīng)選擇性消化分離出表皮層作表皮角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長特征，行細(xì)胞計(jì)數(shù)并描繪細(xì)胞生長曲線圖，采用免疫熒光染色方法對原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

6、　　 結(jié)果:原代細(xì)胞培養(yǎng)約5d后可以觀察到由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞集落，細(xì)胞集落逐漸向外生長。約15d之后，所獲得的細(xì)胞融合形成片狀單細(xì)胞層。可見細(xì)胞呈現(xiàn)出多角形，相互連接呈鋪路石狀。免疫熒光染色可見細(xì)胞角蛋白染色呈陽性，符合人表皮角質(zhì)化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征與生物學(xué)特征。原代培養(yǎng)的正常外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞接種后2d內(nèi)細(xì)胞增殖比較緩慢，第3d起細(xì)胞增殖速度加快，約第7～8d時(shí)達(dá)到峰值，其后細(xì)胞數(shù)量緩慢下降。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)所建立的細(xì)

7、胞系為人正常外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞，該細(xì)胞系的建立為后續(xù)進(jìn)一步探討中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制提供了良好的研究材料。
　　 第三部分EGF對外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞增殖和遷移的影響及其作用機(jī)制
　　 目的:探討EGF對原代培養(yǎng)的外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及遷移能力的影響，并檢測EGF干預(yù)后EGFR、P-EGFR、Akt、P-Akt、cyclinD1等相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況。
　　 方法:分別用EGF、AG1478(EG

8、FR抑制劑)與Wortmannin(PI3K抑制劑)干預(yù)原代培養(yǎng)的外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測其對細(xì)胞生長的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測其對外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞周期的影響;transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測其對外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞遷移能力的影響;Westernblotting方法檢測外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞EGFR、P-EGFR、Akt、P-Akt、cyclinD1等相關(guān)蛋白表達(dá)的改變情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT實(shí)

9、驗(yàn):EGF可以顯著地促進(jìn)原代培養(yǎng)的外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞的增殖，EGF對外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞生長的促進(jìn)作用隨著其作用濃度的提高與作用時(shí)間的延長而增強(qiáng);用AG1478和Wortmannin預(yù)處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AG1478和Wortmannin可以明顯地抑制EGF對外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞的促增殖作用。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù):EGF刺激外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞后可使細(xì)胞S期比例增加，G1期比例減少;而用AG1478和Wortmannin預(yù)處理細(xì)

10、胞后再用EGF刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞G1期比例增加，S期比例減少。
　　 3.Westernblotting:EGF刺激外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞后，P-EGFR表達(dá)快速上調(diào)，干預(yù)40min時(shí)P-EGFR表達(dá)量達(dá)最高值;P-Akt表達(dá)也快速上調(diào)，干預(yù)20min時(shí)P-Akt表達(dá)量達(dá)最高值;cyclinD1表達(dá)在干預(yù)24h后明顯升高。用AG1478和Wortmannin預(yù)處理細(xì)胞后再用EGF刺激細(xì)胞，Westernblotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)P-

11、EGFR、P-Akt和cyclinD1表達(dá)減少。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中EGFR和Akt的總量并無變化。
　　 4.transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):EGF干預(yù)組遷移到下室的外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞平均數(shù)目明顯高于對照組(P＜0.05);AG1478+EGF干預(yù)組與Wortmannin+EGF干預(yù)組遷移到下室的外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞平均數(shù)目明顯少于EGF干預(yù)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.EGF可激活EGFR/PI3

12、K/Akt信號通路，從而促進(jìn)外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞增殖;而EGFR/PI3K/Akt信號通路抑制劑AG1478和Wortmannin則可以抑制該作用。
　　 2.EGF可激活EGFR/PI3K/Akt信號通路，從而增強(qiáng)外耳道表皮角質(zhì)化細(xì)胞的遷移能力，而EGFR/PI3K/Akt信號通路抑制劑AG1478和Wortmannin則可以抑制該作用。
　　 3.EGFR/PI3K/Akt信號通路可能參與了中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制，靶向阻