磷脂酰肌醇3激酶信號途徑在血小板源生長因子誘導肝星狀細胞增殖與Ⅰ型膠原合成中的作用.pdf

1、研究背景 肝纖維化本質上是肝臟對各種慢性損傷的創(chuàng)傷愈合反應。肝纖維化中細胞外基質的量和類型都發(fā)生了變化，其特征性的病理改變是以Ⅰ型膠原為主的細胞外基質蛋白在肝內過度沉積。過度沉積的細胞外基質改變了正常的肝內結構并最終導致肝功能障礙。 肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化過程中細胞外基質的主要生成者，研究表明在肝纖維化中其增殖活性和Ⅰ型膠原的合成能力大大提高。因此，有效地減少HSC合成膠原，抑制細胞的增殖將會減緩肝纖維化的形成。

2、HSC的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，并受多種細胞因子的調節(jié)。血小板源生長因子(PDGF)是HSC最強的有絲分裂原。PDGF能明顯促進HSC的增殖，但是否也促進HSC合成Ⅰ型膠原目前報道不一。PDGF通過磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信號途徑發(fā)揮促細胞增殖作用，這在其他細胞中研究較多，但該通路在HSC的作用報道不多。肝纖維化中信號通路的研究目前比較關注，本研究試圖從細胞信號角度進一步了解纖維化形成的機制。 第一部分

3、 目的：研究PDGF-BB對HSC細胞增殖以及合成Ⅰ型膠原的作用 方法：大鼠的HSC細胞用不同濃度的PDGF-BB培養(yǎng)處理，收集細胞和培養(yǎng)液上清。細胞增殖用MTT法檢測，流式細胞儀檢測細胞周期，Ⅰ型膠原蛋白用ELISA法檢測，RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達。 結果：PDGF-BB在濃度1～10ng/ml時呈劑量依賴性地促進HSC細胞增殖，當濃度大于10ng/ml其促增殖作用達到飽和。PDGF-BB明顯促進細胞

4、的DNA的合成，使細胞大部分處于S期。PDGF-BB能在蛋白和mRNA水平上促進Ⅰ型膠原的合成，并且隨著PDGF-BB處理時間地延長其合成量也增加。 第二部分 目的：研究磷脂酰肌醇3激酶(P13K)特異性的抑制劑LY294002對PDGF誘導的肝星狀細胞增殖與Ⅰ型膠原合成的影響，并初步探討P13K信號通路在PDGF誘導肝星狀細胞活化中的機制。 方法：HSC細胞用LY294002和PDGF-BB共同孵育處理。收集細

5、胞和培養(yǎng)液上清。細胞增殖用MTT法檢測，Ⅰ型膠原蛋白用ELISA法檢測，RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達。利用P13K通路下游效應物AKT作為活化指標，ELISA法檢測AKT和磷酸化AKT蛋白的表達。 結果：5、10、251xmol/1的LY294002均能顯著且劑量依賴性地抑制PDGF-BB刺激的HSC-T6增殖。LY294002能抑制PDGF-BB誘導的HSC細胞合成Ⅰ型膠原。PDGF-BB能激活P13K通路，并導致