磷脂酰肌醇3激酶信號途徑在血小板源生長因子誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖與Ⅰ型膠原合成中的作用.pdf

1、研究背景 肝纖維化本質(zhì)上是肝臟對各種慢性損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)。肝纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)的量和類型都發(fā)生了變化，其特征性的病理改變是以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在肝內(nèi)過度沉積。過度沉積的細(xì)胞外基質(zhì)改變了正常的肝內(nèi)結(jié)構(gòu)并最終導(dǎo)致肝功能障礙。 肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化過程中細(xì)胞外基質(zhì)的主要生成者，研究表明在肝纖維化中其增殖活性和Ⅰ型膠原的合成能力大大提高。因此，有效地減少HSC合成膠原，抑制細(xì)胞的增殖將會減緩肝纖維化的形成。

2、HSC的激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，并受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。血小板源生長因子(PDGF)是HSC最強(qiáng)的有絲分裂原。PDGF能明顯促進(jìn)HSC的增殖，但是否也促進(jìn)HSC合成Ⅰ型膠原目前報道不一。PDGF通過磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信號途徑發(fā)揮促細(xì)胞增殖作用，這在其他細(xì)胞中研究較多，但該通路在HSC的作用報道不多。肝纖維化中信號通路的研究目前比較關(guān)注，本研究試圖從細(xì)胞信號角度進(jìn)一步了解纖維化形成的機(jī)制。 第一部分

3、 目的：研究PDGF-BB對HSC細(xì)胞增殖以及合成Ⅰ型膠原的作用 方法：大鼠的HSC細(xì)胞用不同濃度的PDGF-BB培養(yǎng)處理，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清。細(xì)胞增殖用MTT法檢測，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，Ⅰ型膠原蛋白用ELISA法檢測，RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：PDGF-BB在濃度1～10ng/ml時呈劑量依賴性地促進(jìn)HSC細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度大于10ng/ml其促增殖作用達(dá)到飽和。PDGF-BB明顯促進(jìn)細(xì)胞

4、的DNA的合成，使細(xì)胞大部分處于S期。PDGF-BB能在蛋白和mRNA水平上促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成，并且隨著PDGF-BB處理時間地延長其合成量也增加。 第二部分 目的：研究磷脂酰肌醇3激酶(P13K)特異性的抑制劑LY294002對PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖與Ⅰ型膠原合成的影響，并初步探討P13K信號通路在PDGF誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化中的機(jī)制。 方法：HSC細(xì)胞用LY294002和PDGF-BB共同孵育處理。收集細(xì)

5、胞和培養(yǎng)液上清。細(xì)胞增殖用MTT法檢測，Ⅰ型膠原蛋白用ELISA法檢測，RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)。利用P13K通路下游效應(yīng)物AKT作為活化指標(biāo)，ELISA法檢測AKT和磷酸化AKT蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：5、10、251xmol/1的LY294002均能顯著且劑量依賴性地抑制PDGF-BB刺激的HSC-T6增殖。LY294002能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞合成Ⅰ型膠原。PDGF-BB能激活P13K通路，并導(dǎo)致