克氏原蟹蝦TNFAIP8基因的表達(dá)特征及功能分析.pdf

1、克氏原螯蝦又稱(chēng)淡水小龍蝦，在分類(lèi)學(xué)上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、十足目、螯蝦科，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦品種。在很多地區(qū)已形成大規(guī)模養(yǎng)殖，但在高溫季節(jié)尤其是集約化養(yǎng)殖水體中含有大量細(xì)菌和病毒很容易引發(fā)多種疾病，導(dǎo)致個(gè)體的死亡，對(duì)其經(jīng)濟(jì)收益造成了不利影響。先天免疫是無(wú)脊椎動(dòng)物抵御病原微生物入侵的主要免疫方式，研究無(wú)脊椎動(dòng)物的先天免疫對(duì)于闡明其免疫機(jī)制具有重要的理論意義，同時(shí)對(duì)提高其抗病能力及抗病育種具有一定的實(shí)踐意義。TNFAIP8（tu

2、mor necrosis factorαinduced protein8）是一個(gè)包含有多種蛋白的蛋白質(zhì)家族,與多種自身免疫性疾病、腫瘤等有關(guān)，參與了 NF-κB、Toll等多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控。本研究旨在探討TNFAIP8在克氏原螯蝦免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的功能，取得的主要結(jié)果如下：
　　1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有部分序列，設(shè)計(jì)特異性引物克隆了克氏原螯蝦腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8（TNFAIP8）基因的開(kāi)放閱讀框序列（ORF，open reading

3、frame）。該序列長(zhǎng)564 bp，編碼187個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白的理論分子量為21.4 kDa，等電點(diǎn)為9.038。進(jìn)化樹(shù)分析表明克氏原螯蝦 TNFAIP8基因與無(wú)脊椎動(dòng)物 TNFAIP8基因的親緣關(guān)系最近。
　　2、通過(guò)雙酶切法構(gòu)建了重組質(zhì)粒 PGEX-4T-3-Pc-TNFAIP8，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21后采用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和 Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明克氏原螯蝦TNFAIP8融

4、合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，獲得的重組蛋白分子量大小為40 kDa左右，濃度約為1 mg/mL。
　　3、利用 GST Pull-down技術(shù)從克氏原螯蝦血淋巴蛋白中篩選鑒定了一個(gè)與TNFAIP8相互作用的蛋白—血藍(lán)蛋白（Hemocyanin）。
　　4、提取克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞、腸、鰓、胃、肝胰腺、肌肉、心臟7個(gè)不同組織RNA，通過(guò)熒光定量PCR法分析TNFAIP8基因在不同組織中的表達(dá)分布情況，結(jié)果表明其在各個(gè)組

5、織中均表達(dá)，其中在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量最高，其次為鰓和腸。
　　5、LPS和PolyI:C刺激后克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞、鰓、腸中TNFAIP8基因的表達(dá)量顯著降低，而TNFAIP8重組蛋白誘導(dǎo)和TNFAIP8基因的siRNA干擾處理能夠顯著影響Toll、Serpin、Bcl、Lectin、TNF等相關(guān)免疫基因及 Hemocyanin在血淋巴細(xì)胞及腮中的表達(dá)。
　　綜上所述，TNFAIP8基因在克氏原螯蝦免疫反應(yīng)中具有一定的功能