酶聯(lián)免疫斑點試驗在脊柱結核輔助診斷中的應用研究.pdf

1、研究背景：
　　 目前，結核病(tuberculosis，TB)仍然是當今世界嚴重危害人類健康的傳染性疾病之一，是單一致病菌所致的傳染性疾病中死亡率最高的疾病，同樣也是發(fā)展中國家的頭號傳染性殺手，是全球共同關注的一個嚴重公共衛(wèi)生問題。由于結核致病菌其復雜的生物學特性和全球不同地域的社會因素，加之近幾十年來各國對結核病防治策略的忽視，流動人口增多、多耐藥結核菌增多以及艾滋病的流行，使得結核病在全球范圍內死灰復燃，流行逐漸加劇，大有

2、泛濫之勢，導致結核病疫情呈全球性的回升，這引起了國際社會廣泛的高度重視，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）也將結核病作為重點控制的傳染病之一。據WHO的最新報告，2010年全球有大約880萬新發(fā)結核病例，145萬例死于該病。我國同樣是是全球TB高負擔國家之一，受不同地域人群居住狀況、社會經濟發(fā)展水平、人群衛(wèi)生習慣及文化素質等因素的影響，結核病發(fā)病率居高不下。目前我國結核病患者數量居全球第2位，同時

3、也是耐多藥TB患者數較多的國家之一。廣東省結核病防治任務面臨的形勢同樣非常嚴峻。目前，結核病人報告數始終位居全省甲乙類傳染病報告發(fā)病人數前列，根據相關耐藥性基線調查和2010年全省結核病流行病學抽樣調查，全省每年新發(fā)生菌陽肺結核病人估算在4.6萬例左右，其中耐多藥患者數約0.2萬例。肺結核報告發(fā)病人數中70％以上為農民，且以男性青壯年為主。
　　 骨關節(jié)結核定義為結核分枝桿菌感染骨、關節(jié)、滑膜和脊柱所引起的疾患。其發(fā)病特點包括:

4、發(fā)病隱匿緩慢，病程長，合并癥多，常因骨骺和關節(jié)遭到結核分枝桿菌侵蝕，而影響其骨骼發(fā)育，嚴重者導致殘疾。骨關節(jié)結核是發(fā)病率最高的肺外結核部位，約占結核總發(fā)病率的3-5％，肺外結核發(fā)病率的35-50％以上。而脊柱結核占全身骨結核的首位，約占1/3以上，發(fā)病年齡以20～30歲的青年為高峰。脊柱結核的典型癥狀如腰背部僵硬、疼痛、脊柱局部叩擊痛，全身中毒癥狀，如盜汗、食欲不振、潮熱、乏力等;一旦出現(xiàn)脊柱后凸成角畸形、神經功能（運動、感覺）障礙或竇

5、道形成已為脊柱結核后期改變。相對于這些晚期脊柱結核患者而言，目前需要關注的問題是隨著生活水平的提高及結核菌的變異，脊柱結核患者的癥狀往往不典型，起病隱匿，發(fā)病緩慢，早期臨床癥狀、影像學診斷不明顯。因此，如何在早期實現(xiàn)對脊柱結核的診斷，是所有脊柱外科醫(yī)生需要面對的問題與難題？
　　 眾所周知，脊柱結核如能早期診斷、早期治療，不僅可以制止病變發(fā)展、大大縮短療程、避免或減少畸形發(fā)生、而且可以保全功能、甚至可以不用手術而達到治愈的目的，

6、這樣也可以為國家和患者節(jié)約大量的醫(yī)療成本。文獻報道，非典型性脊柱結核發(fā)生率為2.1％～12.0％，當前脊柱結核延誤診治超過一年的病例約40％，脊柱結核誤診率為32.2％。細菌學檢查仍然是結核病確診的重要手段，是結核病診斷治療及評價治療效果最可靠的標準。結核病人的細菌學檢查，是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，是確定結核病診斷和化療方案的重要依據，也是考核療效，評價治療效果的可靠標準，在結核病防治工作中起著不可缺少的重要作用。但由于結核菌的遺傳

7、特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細菌學檢查方法存在著靈敏度低、操作復雜，需時間較長和影響因素較多，不易標準化等原因，使細菌學診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足臨床診斷的需要。因此，發(fā)展敏感、早期、快速、簡便和預測預后的實驗室診斷技術是結核診斷的必要補充。如果能從免疫學的角度實現(xiàn)對脊柱結核患者的早期診斷并根據具體情況加以治療，可以大大縮短治療的療程，避免或減少畸形發(fā)生、而且可以保全功能、甚至可以不用手術而達到治愈的目的，為可能要接受脊柱結核手術治療

8、的患者節(jié)約大量費用，這樣也可以為國家和社會節(jié)約大量的醫(yī)療成本。
　　 近年來，一種應用在結核感染診斷中的新技術——酶聯(lián)免疫斑點技術(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)越來越得到許多學者與專家的關注。結核感染的免疫應答反應以細胞免疫為主。作為免疫應答的一部分，T細胞受結核抗原刺激致敏，形成活化的效應T細胞，這些T淋巴細胞在體外受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激后可分泌細胞因子γ干擾素(Int

9、erferon-γ，INF-γ）。ELISPOT技術即酶聯(lián)免疫斑點技術，該技術起源于酶聯(lián)免疫吸附試驗，該技術利用體外特異性抗原刺激淋巴細胞后，檢測分泌特異性抗體細胞數量和功能，隨著技術發(fā)展用于檢測單細胞水平分泌特異性細胞因子的功能以及細胞數量。目前ELISPOT技術在肺結核的診斷應用方面取得了良好的效果，但將其應用于脊柱結核的相關應用研究比較缺乏。
　　 目的：
　　 1.探討CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELIS

10、POT方法在脊柱結核輔助診斷中的應用價值。
　　 2.探討T-SPOT.TB試劑盒在脊柱結核輔助診斷中的應用價值。
　　 3.探討非典型性脊柱結核的臨床特點及T-SPOT.TB試驗對其診斷的應用價值。
　　 4.探討ELISPOT試驗對脊柱結核手術前后療效的監(jiān)測作用。
　　 方法：
　　 1.CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT在脊柱結核輔助診斷中的應用研究
　　 2011年

11、5月～2012年7月前瞻性納入南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科和廣州市胸科醫(yī)骨科收治的可疑脊柱結核病例。自行設計受試者信息采集表，收集受試者基本臨床信息:性別、年齡、合并癥、影像學診斷、病理學結果、細菌學結果等，并對受試者出院進一步隨訪（≥6個月）。采集研究對象的外周血單核細胞進行CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT檢測，同時對所有納入者行結核菌素皮膚試驗(PPD)。結合最終臨床診斷和微生物學的診斷，應用靈敏度、特異度、陽性預

12、測值和陰性預測值等指標來評價CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT在脊柱結核輔助診斷中的應用價值，并且進一步探討CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT試驗結果與臨床因素的相關性。
　　 2.探討T-SPOT.TB試劑盒在脊柱結核輔助診斷中的應用價值
　　 2011年5月～2012年8月前瞻性納入南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科和廣州市胸科醫(yī)院骨科收治的可疑脊柱結核病例。自行設計調查量表收集受試者信息，

13、采集研究對象的外周血單核細胞同時行T-SPOT.TB試驗、CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT、Rv2041c-ELISPOT、Rv1419-ELISPOT和Rv0057-1352-ELISPOT檢測，將上述幾種抗原刺激ELISPOT試驗結果兩兩比較。結合最終臨床診斷和微生物學的診斷，應用靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值等指標來評價T-SPOT.TB試驗在脊柱結核輔助診斷中的應用價值，探討Rv2041c、Rv1419

14、和Rv0057-1352在ELISPOT上的應用價值。
　　 3.探討非典型性脊柱結核的臨床特點及T-SPOT.TB對其診斷的應用價值選取2011年3月～2012年9月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科、廣州市胸科醫(yī)骨科、廣東省中醫(yī)院骨科收治的非典型脊柱結核患者29例。由經培訓的脊柱外科醫(yī)生采用自行設計的非典型性脊柱結核信息采集表收集相關人口學信息、臨床特點（癥狀與體征）、實驗室數據及影像學檢查。分析非典型脊柱結核的臨床特征及影像學特

15、點。采集研究對象的外周血行T-SPOT.TB試驗，根據具體情況同時對所納入的研究對象行PPD試驗、抗酸桿菌涂片檢查、病灶病理學檢查和病灶結核分枝桿菌培養(yǎng)等，結合最終臨床診斷和微生物學的診斷，來評價T-SPOT.TB試驗在非典型性脊柱結核診斷中的應用價值。
　　 4.探討ELISPOT試驗對脊柱結核手術前后的療效監(jiān)測作用
　　 連續(xù)選取2012年3月～2012年6月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科接受外科手術治療的脊柱結核患者

16、12例。自行設計調查量表收集受試者信息，分別在患者入院時、手術前2天和手術后2天采集受試患者的外周血行T-SPOT.TB試驗，觀察脊柱結核患者手術前后體內效應T細胞的反應情況。
　　 結果：
　　 1.CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT在脊柱結核輔助診斷中的應用研究
　　 ①標本獲取及檢測情況
　　 在納入的102例患者中，有11例因未能完成ELISPOT試驗或者失訪被剔除出此項研究。其中

17、確診為脊柱結核組的有52例，確診為非脊柱結核疾病組的有39例。最終納入的91例患者均接受了CFP-10/ESAT-6融合蛋白-ELISPOT方法、PPD皮膚試驗和血清抗結核抗體檢測。52例脊柱結核患者中共有47例接受活檢穿刺病理檢測，42例患者行抗酸桿菌涂片檢查，40例患者行結核分枝桿菌培養(yǎng)。
　　 ②脊柱結核組和非脊柱結核疾病組ELISPOT形成SFC數量的比較
　　 CFP-10/EAST6融合抗原-ELISPOT形

18、成SFC數量在脊柱結核組和非脊柱結核疾病組間存在極顯著差異，CFP-10/EAST6融合抗原-ELISPOT在脊柱結核組形成SFC數量顯著高于非脊柱結核疾病組形成的SFC數量。
　　 ③ELISPOT方法與臨床常用診斷方法陽性率比較
　　 在整個研究過程中，PPD皮膚試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為61.5％、46.2％、60.4％和47.4％;血清抗結核抗體試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值

19、分別為55.8％、61.5％、65.9％和51.1％;CFP-10/EAST6融合抗原-ELISPOT試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為82.7％、87.2％、89.6％和79.1％。脊柱結核組中，ELISPOT試驗總體陽性率高于PPD皮膚試驗和血清抗結核抗體試驗(P＜0.05)。
　　 ④脊柱結核組ELISPOT試驗與PPD皮膚試驗、抗結核抗體試驗和病理學檢查的配對比較
　　 經過貯檢驗，CFP-10/

20、EAST6融合抗原-ELISPOT試驗檢測結果與PPD皮膚試驗結果比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與血清抗結核抗體試驗結果比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與病理學檢測結果比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。病理學檢查結果與ELISPOT試驗結果有著較好的一致性。
　　 ⑤脊柱結核組ELISPOT試驗與臨床特征的相關性
　　 研究顯示年齡、營養(yǎng)狀況與SFC數量及ELISPOT最終陽性率有著密切聯(lián)系。
　　 2.探

21、討T-SPOT.TB試劑盒在脊柱結核輔助診斷中的應用價值
　　 ①研究對象及檢測標本情況
　　 在納入的70例患者中，有5例失訪被剔除出此項研究。其中確診為脊柱結核組的有34例，確診為非脊柱結核疾病組的有31例。
　　 ②T-SPOT.TB試劑盒與常規(guī)結核檢測方法的比較
　　 在整個研究過程中，PPD皮膚試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為61.8％、58.1％、61.8％和58.1％;血清

22、抗結核抗體試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為58.8％、70.9％、68.9％和61.1％;T-SPOT.TB試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為85.3％、77.4％、80.6％和82.8％。脊柱結核組中，T-SPOT.TB試驗總體靈敏度高于PPD皮膚試驗和血清抗結核抗體試驗。
　　 ③脊柱結核組T-SPOT.TB試劑盒與PPD皮膚試驗、抗結核抗體試驗和病理學檢查的配對比較
　　 脊柱結核

23、組中，經過x2檢驗，ELISPOT試驗檢測結果與PPD皮膚試驗結果比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與血清抗結核抗體試驗結果比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與病理學檢測結果比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。病理學檢查結果與T-SPOT.TB試驗結果有著較好的一致性（一致率:93.8％; Kappa值:0.714，P＜0.05）。
　　 ④Rv2041c-ELISPOT、Rv1419-ELISPOT和Rv0057-1352-EL

24、ISPOT技術檢測脊柱結核病人反應情況與試驗條件的確定
　　 通過對10例脊柱結核患者的預實驗觀察，并與CFP-10/ESAT-6-ELISPOT的試驗結果相比，Rv1419-ELISPOT試驗的反應情況較好，而Rv2041c-ELISPOT和Rv0057-1352-ELSPPOT的反應較弱，在以上研究基礎上，選取2.0×105個細胞加入96孔培養(yǎng)板，孵育時間分別為20h，結果顯示20μg/ml和40μg/ml蛋白濃度斑點強度相

25、似，最終選取20μg/ml為Rv1419-ELISPOT的終濃度。
　　 ⑤脊柱結核組中不同抗原ELISPOT診斷靈敏度的比較
　　 CFP-10/ESAT-6-ELI SPOT的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值為:82.4％、83.9％、84.8％和71.9％。T-SPOT.TB試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為:85.3％、77.4％、74.4％和80.8％，且兩種檢測結果有著較好的一致性。

26、r>　　 3.非典型性脊柱結核的臨床特點及T-SPOT.TB試驗對其診斷的應用價值
　　 ①非典型性脊柱結核患者的臨床癥狀和體征
　　 從研究納入的29例非典型性脊柱結核患者臨床特點中，可以獲知腰背痛是最主要的臨床主訴（24例，82.8％）。
　　 ②非典型性脊柱結核患者的影像學特征
　　 29例患者主要的影像學特征為:(1)軟骨終板終板蟲蝕樣破壞:本組5例，在MRI上見椎體軟骨終板蟲蝕樣破壞，見于椎體

27、型或以椎體型為主的跳躍型脊柱結核;(2)單一椎體的中心性塌陷或者單一椎體輕度壓縮改變:本組5例;(3)多發(fā)性脊柱結核包括連續(xù)性和跳躍性脊柱結核:本組15例;(4)影像學局部破壞重，而臨床全身癥狀輕，即冷膿腫形成，但無明顯骨破壞:本組4例。
　　 ③T-SPOT.TB試驗與常規(guī)結核檢測方法的比較
　　 非典型性脊柱結核組中病灶抗酸桿菌涂片和結核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率分別為37.5％和78.3％。在整個研究過程中，PPD皮膚試

28、驗的陽性率為58.6％，血清抗結核抗體試驗的陽性率為62.1％，T-SPOT.TB試驗的陽性率為82.8％。
　　 4.ELISPOT試驗對脊柱結核手術前后療效監(jiān)測的作用
　　 ①患者基本情況分析
　　 本次研究共納入12例脊柱結核患者，其中有3例脊柱結核患者行單純結核病灶清除術，5例脊柱結核患者行一期前路病灶清除植骨融合內固定術，4例脊柱結核患者行一期前路病灶清除椎間植骨并后路椎弓根螺釘系統(tǒng)固定術。
　　

29、 ②脊柱結核患者入院時，手術前后SFC數目的比較分析
　　 12例脊柱結核患者入院時，手術前后對應ESAT-6的SFC平均數目分別為35.0±22.4、36.7±23.8、30.1±16.2;對應CFP-10的SFC平均數目分別為55.1±68.5、57.4±68.3、44.1±47.9。經過配對樣本t檢驗，患者入院時與手術前、手術前與手術后ESAT-6和CFP-10刺激形成的SFC數量比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

30、r>　　 結論：
　　 1.以CFP-10/ESAT-6融合蛋白作為抗原的ELISPOT法應用于脊柱結核診斷有著良好的靈敏度和特異度，能為脊柱結核感染患者提供有效的輔助診斷。
　　 2.T-SPOT.TB試驗在脊柱結核的診斷中有著較高的靈敏度（尤其是非典型性脊柱結核的診斷），可能成為脊柱結核感染早期診斷的一項重要的篩查工具，并輔助脊柱結核病的診斷。
　　 3.結核分枝桿菌Rv1419融合抗原具有較好的脊柱結核免