酶聯(lián)免疫斑點法快速診斷活動性結核病的臨床應用研究.pdf

1、[目的]
　　評估基于6KD早期分泌靶抗原(early secreting antigen target6KD，ESAT-6)和10KD培養(yǎng)濾液蛋白(culture filtrate protein10KD，CFP-10)抗原肽的酶聯(lián)免疫斑點技術(Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT)在高發(fā)病率國家診斷活動性結核病的真實性、可靠性和診斷價值。探討ELISPOT快速診斷痰液結核分枝桿菌培養(yǎng)和痰

2、涂片抗酸桿菌檢查(Acid Fast Bacilli，AFB)陰性結核病、兒童結核病和肺外結核病的可行性。
　　[方法]
　　整群選取在2011年3月至8月期間到廣西南寧市第四人民醫(yī)院醫(yī)院住院治療的痰液細菌學培養(yǎng)陽性或組織病理學確診的活動性結核病人140例作為結核病組，其中細菌學培養(yǎng)陽性90例，陰性36例。整群選取同期到該醫(yī)院住院治療的非結核病人98例作為對照組。收集研究對象的外周血單核細胞進行ELISPOT(T SPOT.

3、TB; OxfordImmunotec Ltd.，Abingdon，UK)檢測，同時進行結核菌素皮膚試驗(Tuberculin skin test，TST)。結合最終臨床診斷和微生物學的診斷，應用靈敏度、特異度、陽性預測值(Positive predictivevalue，PPV)、陰性預測值(Negative predictive value，NPV)、陽性似然比(Positive Likelihood Ratio)、陰性似然比(Ne

4、gative Likelihood Ratio)、約登指數(shù)、診斷OR值和ELISPOT和TST的檢測結果一致性等指標評價ELISPOT和TST在常規(guī)臨床實踐中診斷活動性結核病的真實性、診斷價值和可靠性。應用單因素和多因素非條件Logistic回歸模型分析ELISPOT和TST靈敏度和特異度的影響因素。
　　[結果]
　　(1)ELISPOT斑點形成細胞(Spot forming cells，SFCs)分布:①結核組ESAT-

5、6形成的SFCs數(shù)的中位數(shù)(74個/2.5×105PBMCs)顯著高于對照組(11個/2.5×105PBMCs)(P＜0.001)，結核組CFP-10形成的SFCs數(shù)的中位數(shù)(100個/2.5×105PBMCs)也顯著高于對照組(9個/2.5×105PBMCs)(P＜0.001)。②涂陽和涂陰結核組ESAT-6形成的SFCs數(shù)的中位數(shù)(92個和74個/2.5×105PBMCs)均高于對照組(11個/2.5×105PBMCs)，差異有統(tǒng)計

6、學意義(P＜0.001)，涂陽和涂陰結核組CFP-10-ELISPOT形成的SFCs數(shù)的中位數(shù)(150個和100個/2.5×105PBMCs)均高于對照組(9個/2.5×105PBMCs)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。③結核病例ESAT-6和CFP-10抗原肽形成SFCs數(shù)與年齡、BMI指數(shù)和抗結核治療時間等影響因素存在關聯(lián)（P均＜0.05），與性別、BCG接種、既往結核病史、家庭接觸結核病人和免疫抑制等其他影響因素均無關聯(lián)（P

7、均＞0.05）。
　　(2)TST硬結直徑分布:①病例組和對照組TST硬結直徑中位數(shù)分別為7.00mm(0～27.00mm)和4.50mm(0～15.00mm)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007)。涂陽結核病組TST的硬結直徑中位數(shù)是8.0mm(0～14.0mm)，涂陰結核病組硬結直徑中位數(shù)是7.0mm(0～27.0mm)，對照組TST的硬結直徑中位數(shù)是4.5mm(0～15.0mm)，三組病人TST硬結直徑分布比較，差異有統(tǒng)計學意

8、義（x2=7.912，P=0.023)。涂陽和涂陰結核病組TST硬結直徑分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），涂陽結核病組和涂陰結核病組硬結直徑均大于對照組，分布差異有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。②在14例兒童結核病例和16例兒童對照者中，病例組TST的硬結直徑中位數(shù)是10.8mm(0～21.0mm)，對照組TST的硬結直徑中位數(shù)是3.5mm(2.0～15.0mm)，病例組的硬結直徑顯著大于對照組(P=0.008)。
　　(3

9、)ELISPOT與TST總體診斷真實性與診斷價值:①ELISPOT診斷結核病的總體靈敏度為89.3％(95％CI:83.1-93.4)，特異度為82.7％(95％CI:74.0-88.9)，約登指數(shù)為0.72，PPV為88.0％(95％CI:81.7-92.4)，NPV為84.4％(95％CI:75.8-90.3)。②TST(≥5mm)診斷活動性結核病的總體靈敏度為68.3％(95％CI:59.6-75.9)，特異度為51.0％(95％

10、CI:41.3-60.7)，約登指數(shù)為0.193，PPV為63.6％(95％CI:55.2-71.4)，NPV為56.2％(95％CI:45.8-66.0)。TST(≥10mm)診斷結核病的總體靈敏度為35.8％(95％CI:27.9-44.6)，特異度為91.8％(95％CI:84.7-95.8)，約登指數(shù)為0.276，PPV為84.6％(95％CI:72.5-91.2)，NPV為53.3％(95％CI:45.7-60.6)。痰涂片抗

11、酸染色檢查的靈敏度為22.1％（95％CI:15.9-29.7）。③ELISPOT的靈敏度、特異度、PPV和NPV均顯著高于TST(≥5mm)(P值均＜0.001)，ELISPOT的靈敏度和NPV顯著高于TST(≥10mm)(P＜0.001)，特異度低于TST(≥10mm)，PPV高于TST(≥10mm)，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。④ELISPOT、TST(≥5mm)和TST(≥10mm)陽性檢測結果的活動性結核病診斷OR值

12、分別為39.71(95％CI:18.78～83.93)、2.24(95％CI:1.30～3.88)和6.27(95％CI:2.78～14.11)。
　　(4)菌陽和菌陰結核病人ELISPOT和TST診斷靈敏度:①菌陽結核病人中，ELISPOT和TST診斷靈敏度分別為97.8％(45/46，95％CI:88.7～99.6)和90.0％(27/30，95％CI:74.4～96.5)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.33)。②菌陰結核病人中，

13、ELISPOT和TST診斷靈敏度分別為86.7％(78/90，95％CI:78.1～92.2)和59.6％(53/89，95％CI:49.2～69.2)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　(5)肺外結核病人ELISPOT和TST診斷靈敏度:28例肺外結核病例中，ELISPOT陽性靈敏度(85.7％)高于TST(70.8％)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.19)。4例結核性腦膜炎患者的ELISPOT結果都是陽性(100％)，但只

14、有2例(50％) TST陽性。
　　(6)兒童結核病人ELISPOT和TST診斷真實性與診斷價值:①14個兒童活動性結核病例和16個兒童對照中，ELISPOT靈敏度為85.7％(95％CI:60.1～95.0)，特異度為93.8％(95％CI:71.7～98.9);②TST靈敏度為71.4％(95％CI:45.4～88.3)，特異度為56.3％(95％CI:33.2～76.9)。③ELISPOT的靈敏度高于TST，但無統(tǒng)計學意義（

15、P＞0.05）;ELISPOT的特異度顯著高于TST(P＜0.05)。
　　(7)ELISPOT和TST診斷結果一致性:①ELISPOT和TST總一致性較差（k=0.24）。在活動型結核病組中，ELISPOT和TST一致性較差(k=0.071)，類似地，在對照組中，ELISPOT和TST一致性也較差(k=0.15)。不一致的檢測結果在結核病組中常見ELISPOT陽性而TST陰性（33例），而在對照組中常見于ELISPOT陰性而TS

16、T陽性（36例）。②在14個兒童活動型結核病例和16個兒童對照者中，ELISPOT和TST總一致性較差(k=0.35)。在結核病組中，ELISPOT和TST一致性較差（k=0.18），類似地，在對照組中，ELISPOT和TST一致性也較差(k=0.16)。不一致的檢測結果在病例組中常見ELISPOT陽性而TST陰性（3例），而在對照組中常見于ELISPOT陰性而TST陽性(7例)。
　　(8)ELISPOT和TST靈敏度影響因素:

17、①多因素分析顯示，ELISPOT靈敏度未受研究對象性別、年齡、BMI指數(shù)、接種卡介苗、既往結核病史、家庭接觸結核病人、免疫抑制等因素的影響（P值均＞0.05）。②多因素分析顯示BMI指數(shù)＜18.5(OR=0.22，95％CI:0.08～0.59)、接種卡介苗(OR=4.36，95％CI:1.25～15.26)、家庭接觸結核病人(OR=6.61，95％CI:1.69～25.93)、有免疫抑制(OR=0.076，95％CI:0.016～0.

18、37)等4個因素（P值均＜0.05）是TST靈敏度的獨立影響因素。提示營養(yǎng)不良、有免疫抑制更易使TST靈敏度降低，而接種卡介苗和家庭接觸結核病人更易使TST靈敏度升高。
　　(9)ELISPOT和TST特異度影響因素:①多因素分析顯示，ELISPOT假陽性率未受研究對象性別、年齡、BMI指數(shù)、接種卡介苗、免疫抑制等因素的影響（P值均＞0.05）。但既往結核病史(多因素分析OR=7.89，95％CI:1.15～54.02)、家庭接觸

19、結核病人（多因素分析OR=12.71，95％CI:2.56～63.22）是ELISPOT假陽性率的影響因素（P值均＜0.05）。提示家庭接觸結核病人和既往結核病史更易使ELISPOT特異度降低。②多因素分析顯示BMI指數(shù)＜18.5(OR=0.18，95％CI:0.04～0.82)、接種卡介苗(OR=12.73，95％CI:3.49～46.50)、既往結核病史(OR=83.85，95％CI:6.77～1038.38)、家庭接觸結核病人(O

20、R=21.69，95％CI:2.24～210.29)等4個因素（P值均＜0.05）是TST假陽性率的獨立影響因素。提示營養(yǎng)不良更易使TST特異度升高，而接種卡介苗、既往結核病史和家庭接觸結核病人更易使TST特異度降低。
　　[結論]
　　(1)基于ESAT-6和CFP-10抗原肽的ELISPOT技術在高發(fā)病率背景下診斷活動性結核病具有較高的診斷靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和診斷OR值，ELISPOT診斷活動性結核病

21、的真實性、可靠性和診斷價值均高于TST。TST診斷靈敏度與特異度均較低，對活動性結核病的診斷的參考意義有限。
　　(2)ELISPOT的靈敏度不受研究參與者年齡、卡介苗接種、結核病接觸史、既往結核病史和免疫抑制狀況的顯著影響，特異度也未受接種卡介苗的影響而降低，檢測結果比TST更為可靠。
　　(3)ELISPOT也有明顯的缺點，例如不能很好區(qū)分活動性結核病患者和潛伏性結核感染者，家庭接觸結核病人和既往結核病史更易使ELISP

22、OT特異度降低;由于人類白細胞抗原限制性，無法完全排除假陰性結果;T-SPOT-TB試劑盒價格較昂貴，難以在經濟發(fā)展水平較低的地區(qū)推廣應用，用于大規(guī)模普查結核病也是不現(xiàn)實的。對于TST硬結直徑≥10mm、痰涂片抗酸桿菌檢查陽性結核病人可不做ELISPOT檢測。
　　(4)ELISPOT適合作為高發(fā)病率背景下臨床實踐中診斷活動性結核病，特別是涂陰結核病、肺外結核病和兒童結核病的可靠的輔助診斷手段，這有助于病例得到更快速的診斷和治療，